Optimalizace Biotechnologie Lentikats® pro denitrifikaci vod s vysokým obsahem solí Josef Trögl, Věra Pilařová, Jana Měchurová, Jana Krudencová, Pavel Janoš, Alžběta Boušková, Jan Mrákota, Lucie Čechovská, Radek Stloukal Univerzita J. E. Purkyně, Ústí nad Labem Fakulta životního prostředí LentiKat’s a.s., Praha

Obsah 1.Cíle projektu 2.Experimentální a analytická část 3.Kinetické testy s proměnlivou koncentrací dusičnanů 4.Kontinuální experimenty 5.Kinetické testy s proměnlivou koncentrací solí 6.Doplňkové experimenty 7.Souhrny, závěry a hypotézy 8.Výstupy

1. Cíle projektu Cíl: Optimalizovat Biotechnologii Lentikats pro kontinuální odstraňování dusičnanů z eluátů iontoměničových kolon Potenciální komplikace: –inhibice denitrifikace vysokou koncentrací solí –jiná inhibice imobilizovaných mikroorganismů vysokou koncentrací solí –nedostatek živin pro reprodukci imobilizovaných bakterií –vliv solí na stabilitu PVA matrice

1. Eluáty dle zadání Složení –NaCl 20 g/l –Na 2 SO 4 2 g/l –NO 3 - až 10 g/l

Složení –NaCl 20 g/l –Na 2 SO 4 2 g/l –NO 3 - až 10 g/l 1. Eluáty dle zadání = 100% matrice

1. Alternativy řešení 1. Denitrifikace při 100% matrici 2. Denitrifikace při zředěné matrici –v případě inhibice kinetiky denitrifikace solemi  nejmenší ředění pro maximální rychlost denitrifikace –není žádoucí – spotřeba vody

2. Experimentální část

Biokatalyzátor lentikats (BL) –denitrifikační s imobilizovanou čistou kulturou Paracoccus denitrificans – kulovitá G- bakterie, fakultativně anaerobní, schopná částečně aerobní denitrifikace –1 kg vlhkého BL / reaktor –skladování ve skladovacím médiu

2. Experimentální část Reaktor –skleněný, trubkovitý –pracovní objem 10 litrů (vsádkové exp.) resp. 11 litrů (kontinuální exp.). –míchání lopatkovitým míchadlem cca rpm pro udržení BL ve vznosu –sondy pH, O 2, teplota

2. Experimentální část Simulované eluáty –příprava z p.a. chemikálií a destilované vody Přidavek org. substrátu –ethanol (absolutní, p.a.) –obvykle 4,2 g CHSK / g N-NO 3 (přebytek)

2. Experimentální část Vsádkové pokusy příprava 1. Promytí čoček odstátou pitnou vodou (obvykle cca 3x3litry) 2. Naplnění reaktoru 8 litry slané vody 3. Úprava pH na cca 7 (dle potřeby) 4. Přídavek 2 litrů roztoku KNO3 5. Start přídavkem ethanolu

2. Experimentální část Vzorkování: –pipetou 5 ml z reaktoru do 25 ml odměrné baňky na stanovení aniontů –10 ml na CHSK (konzervace 0,1 ml H 2 SO 4 1:1) –5 ml na zákal (OD při 600 nm)

2. Experimentální část Analýzy –Dusičnany iontovou chromatografií –Dusitany spektrofotometricky (set Spektroquant, Merck) –CHSK dichromanovou metodou (činidla Merck) –OD spektrofotometricky při 600 nm

2. Experimentální část Analýzy –Obvykle interference chloridů se stanovením – nutné ředění vzorků 10-25x –Meze stanovitelnosti NO mg/l NO ,5 mg/l CHSK 100 mg/l

2. Experimentální část Skladování vzorků –OD měřeno okamžitě –Dusičnany, dusitany stanoveny do 48 hodin (skladování v lednici 5x zředěné) výjimečně déle – zamražení vzorků –CHSK stanovena po delší době v blocích – skladování po fixaci H 2 SO 4 v lednici

3. Vsádkové testy s proměnlivou koncentrací NO 3 -

Cíl: –Nahlédnout do kinetiky v přítomnosti solí –Zjistit závislost kinetiky na koncentraci dusičnanů –Zjistit limitní koncentrace dusičnanů Koncentrace: –0,1 – 0,5 – 1 – 5 – 10 g/l NO 3 - –100% matrice

3. Vsádkové testy s proměnlivou koncentrací NO 3 - Celkem 20 experimentů –tři na rozjezd (1. s glukózou)

3. Vsádkové denitrifikace pokus 8, 10 g/l NO 3 -, 100% solí

3. Vsádkové testy s proměnlivou koncentrací NO 3 - Kinetika denitrifikace –zpočátku cca lineární úbytek dusičnanů –kumulace dusitanů – maximum –cca lineární úbytek CHSK –vzestup pH na cca 9

3. Počáteční lineární rychlost odbourávání N-NO 3

3. Celková rychlost odbourávání N-tot

3. Čas 1 kg BL na odstranění 1 g N-tot

3. Vliv počátečních dusičnanů

3. Vliv počátečních dusičnanů – bez 10 g/l

3. Vliv počátečních dusičnanů – bez prvních 5 pokusů

3. Souhrn Aktivita BL časem průběžně klesala Lineární závislost rychlosti na koncentraci dusíku je spíš způsobena systematickou odchylkou pořadí pokusů Malá opakovatelnost (hlavně u pokusů s 10 g/l dusičnanů)

4. Kontinuální pokusy

100% matrice Proměnlivý obsah NO 3 - v nátokové vodě Proměnlivý průtok Přebytek CHSK 4,2 g CHSK / g N 1 kg BL použitého v předchozí etapě

4. Kontinuální pokusy PokusOdDoDélka [dny] Průtok [ml/hod] Nátok N [mg/ hod] Max. v odbourá- vání [mg/hod]

4. Pokus 28 Před začátkem 2x regenerace, 5 g/l NO 3 - Start do nátokové vody (3,5 g/l NO 3 - ) Průtok 180 ml / hod Aktivita BL > zatížení

4. Pokus 28

4. Pokus 34 Bez předchozí regenerace Start do nátokové vody (3,5 g/l NO 3 - ) Průtok 309 ml / hod Aktivita BL > zatížení

4. Pokus 34

4. Pokusy Bez regenerace Před startem jen 2 rozjezdové pokusy (1 g/l) po vánoční přestávce Start do nátokové vody (3,5 g/l NO 3 - ) Průtok 309 ml / hod, po 10 dnech zvýšeno na 406 ml / hod Ke konci neplánované zvýšení průtoku (chyba analýzy)

4. Pokusy 37+43

4. Pokusy Bez regenerace Start do nátokové vody (5,5 g/l NO 3 - ) Průtok 230 ml/hod, později snížení koncentrace nátokové vody na 3,5 g/l NO dny bez nátoku pro odstranění veškerého N

4. Pokusy 50+62

4. Pokus 79 Po předchozí opakované regeneraci Start do slané vody bez dusičnanů Postupné zvyšování a později snižování nátoku Dusičnany 5,5 g/l

4. Pokus 79

4. Regenerace před pokusem 79 Po předchozí opakované regeneraci Start do slané vody bez dusičnanů Postupné zvyšování a později snižování nátoku Dusičnany 5,5 g/l

4. Regenerace před pokusem 79

5. Vsádkové denitrifikace – ředění matrice

Cíl: Sledovat, zda se zlepšuje kinetika při zředění výchozí matrice na nižší koncentraci solí. Pokusy: sada vsádkových pokusů se stejnou koncentrací dusičnanů (5 g/l) a CHSK (4,2 g / g N) a proměnlivou koncentrací matrice

5. Ředění matrice 1. sada pokusů –Sekvence pokusů s ředěním matrice 40% - 60% - 80% - 100% –4 opakování od každého Regenerační pokusy (4 za sebou) 2. sada pokusů –zopakování 1. sady (1 opakování) + ředění 70%, 20%, 150% –denitritace v roztoku solí –vložené regenerace pro udržení maximální aktivity BL

5. Ředění – experimenty chronologicky

5. Ředění – kinetika odbourávání dusičnanů

5. Ředění matrice – kinetika odbourávání dusitanů

5. Odbourávání dusitanů - závěry Do 100% žádná zjevná závislost mezi matricí a kinetikou denitritace 150% matrice inhibující Odbourávání v KM bylo výrazně rychlejší než ve slaných roztocích –rychlost odbourávání dusičnanů po regeneraci BL je srovnatelná u KM i eluátů Vliv teploty

5. Ředění matrice – kinetika odbourávání dusitanů

5. Ředění matrice - korelace Kinetické parametry –lineární rychlost odbourávání N-NO3 a N-tot –čas potřebný na odbourání 1 g N-tot 1 kg BL Potenciální parametry ovlivňující kinetiku –průměrná teplota (vážený průměr) –průměrné pH (vážený průměr) –počáteční pH –čas od posledního oživení Ostatní –Čas maxima dusitanů –dosažené maximum dusitanů

5. Ředění matrice – korelace Ma- trice lin v N- NO3 lin v Ntot t na 1 g N tot prům. tep. prům. pH pH start Čas od oživen í NO2 max t NO2 max Matrice1,00-0,13-0,280,420,040,410,240,570,290,20 lin v N-NO3 - 0,131,000,87-0,810,790,000,20-0,56-0,910,41 lin v Ntot - 0,280,871,00-0,840,61-0,090,11-0,65-0,860,16 t na 1 g N tot0,42-0,81-0,841,00-0,620,10-0,130,800,820,00 prům. tep.0,040,790,61-0,621,00-0,130,17-0,34-0,710,24 prům. pH0,410,00-0,090,10-0,131,000,490,03-0,050,06 pH start0,240,200,11-0,130,170,491,00-0,20-0,290,23 Čas od oživen í 0,57-0,56-0,650,80-0,340,03-0,201,000,590,14 NO2 max t0,29-0,91-0,860,82-0,71-0,05-0,290,591,00-0,35 NO2 max0,200,410,160,000,240,060,230,14-0,351,00  = 0,95

5. Ředění matrice – korelace Ma- trice lin v N- NO3 lin v Ntot t na 1 g N tot prům. tep. prům. pH pH start Čas od oživen í NO2 max t NO2 max Matrice1,00-0,13-0,280,420,040,410,240,570,290,20 lin v N-NO3-0,131,000,87-0,810,790,000,20-0,56-0,910,41 lin v Ntot-0,280,871,00-0,840,61-0,090,11-0,65-0,860,16 t na 1 g N tot0,42-0,81-0,841,00-0,620,10-0,130,800,820,00 prům. tep.0,040,790,61-0,621,00-0,130,17-0,34-0,710,24 prům. pH0,410,00-0,090,10-0,131,000,490,03-0,050,06 pH start0,240,200,11-0,130,170,491,00-0,20-0,290,23 Čas od oživen í 0,57-0,56-0,650,80-0,340,03-0,201,000,590,14 NO2 max t0,29-0,91-0,860,82-0,71-0,05-0,290,591,00-0,35 NO2 max0,200,410,160,000,240,060,230,14-0,351,00  = 0,95

5. Korelace - nejdůležitější závěry Faktory ovlivňující kinetiku: 1.čas od posledního oživení 2.teplota 3.matrice –slabá korelace jen s časem na odbourání 1 g N- tot –žádná korelace s lineární rychlostí Slabá korelace matrice a času od oživení – potenciální systematická chyba

6. Doplňkové experimenty Vliv fosforu na kinetiku při 40% ředění Vliv zákalu na kinetiku při 40% ředění Růstové křivky P. denitrificans v různých médiích

6. Vliv přídavku fosforu Hypotéza: Fosfor je jediný makroprvek chybějící v eluátech. Jeho přídavek by mohl urychlit denitrifikaci. po předchozí regeneraci (2x) 40% matrice 4 g/l NO 3 - přídavek 0,02 g P na 1 g N-NO 3 –Na 2 HPO 4 + KH 2 PO 4 v poměru na pH 7

6. Vliv přídavku fosforu

Spíše vliv skladování přes Vánoce než přídavku fosforu

6. Vliv volných buněk K předchozímu pokusu s vysokou volnou biomasou se přidaly dusičnany a ethanol Sledování vlivu počátečního zákalu na kinetiku

6. Vliv volných buněk

Málo pokusů Málo dat Žádný relevantní závěr

6. Růstové křivky v různých médiích Volné buňky získané z odtoku z pokusu 79 –zákal obsahuje množství kulovitých buněk barvících se negativně dle Grama (=pravděpodobně P. denitrificans) Měření OD a dusíku 100 ml láhve s uzávěrem („pyrexky“) 1 g/l NO  l etanolu cca anaerobně

6. Srovnání KM vers. eluáty Generační doba = 12,2 hod

6. Růstové křivky v různých médiích Kromě KM média nebyl zaznamenán růst Přídavek fosforu neudělá z eluátu kultivační médium –pravděpodobně chybí další živiny

6. Srovnání solí Růstové křivky v KM s přídavky solí % Měření OD a dusičnanů

6. Srovnání solí

6. Závěry – celkové Soli v testovaném rozsahu mají velmi malý vliv na kinetiku denitrifikace Aktivita BL bez regenerace systematicky klesá Při kontinuálních experimentech bylo dosaženo cca měsíce provozu bez poklesu aktivity

7. Nevyřešené otázky a hypotézy Proč aktivita BL v eluátech rychle klesá, když jinak vydrží měsíce i roky? –Negativní vliv osmotického tlaku (spíše ne) –Nedostatek živin (spíš ano – v eluátech se P. denitrificans nemůže množit) –Vyplavování buněk z matrice (nedořešená otázka, je třeba dále testovat) otázka vlivu solí na matrici

7. Nevyřešené otázky a hypotézy Proč v kontinuálním pokusu došlo k poklesu aktivity po snížení zátěže?50+62

7. Nevyřešené otázky a hypotézy Jak souvisí pokles aktivity systému s poklesem volné biomasy? Jaká je zadržovací schopnost BL pro živiny?

7. Nevyřešené otázky a hypotézy Kde se bere v systému volná biomasa, když složení eluátů neumožňuje její rozmnožování? –Nemohou se buňky uvolňovat z PVA matrice? –Nenarušují soli PVA matrici?

7. Nevyřešené otázky a hypotézy Proč se při opakovaných regeneracích vyskytuje dodatečný vzestup aktivity? –odkaz 1odkaz 1 –odkaz 2odkaz 2 –Překultivace?

7. Nevyřešené otázky a hypotézy Uvolňování buněk z matrice –Vzestup zákalu je lineární, u regeneračních pokusů exponenciální (únik vers. množení) –Zákal stoupá i po vyčerpání dusíku

7. Další problémy k řešení Přesné a jednoduché stanovení imobilizované biomasy –celkový N (pro denitrifikanta nevhodné) –celkový fosfor –organický uhlík (interference s externí CHSK) –lipidy –bílkoviny –???

8. Předpokládané výstupy Výzkumná zpráva – předána za 1. etapu, po skončení kompletní Konference Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi – 8. a 9.10., full text do sborníku odeslán Články Plán 1-2 články do časopisu s IF Ověřená technologie