biotechnologie - úvod BIOTECHNOLOGIE každá technologie, která využívá živé organismy nebo jejich součásti k výrobě nebo modifikaci nějakého produktu představuje integrované požití biochemie, mikrobiologie a inženýrských disciplín pro výrobu nebo modifikaci produktu podle definice technologie je to úplný soubor postupů pro průmyslovou výrobu nějakého produktu s využitím buněk živého organismu

biotechnologie - úvod Biotechnologie x chemická technologie Rozdíly:je potřebná aseptičnost (sterilita) surovin a zařízení vzhledem k využívání živých organismů používání odlišných izolačních a čistících postupů produkty jsou choulostivé na změny teploty a pH čistota musí být vysoká (farmaceutické výrobky) náklady na separaci a čistění mohou tvořit až 50% celkových výrobních nákladů Společné rysy:používání podobných až shodných postupů a zařízení, rozdíly jsou dány specifitou postupu (použití živých organismů)

biotechnologie - úvod Vývoj biotechnologií 1)Počáteční období – do pol. 19. století nejstarší postupy s empirickým využíváním divokých kultur mikroorganismů klasické fermentační technologie (pivo, víno, ocet, sýry, kyselé zelí, …) 2)Období Pasteura – 2. pol. 19. stol – 30. léta 20. stol. Louis Pasteur ( ) – otec mikrobiologie za rozkladné procesy jsou odpovědné mikroorganismy výroba ethanolu, acetonu, kyseliny octové a mléčné, biologické čištění odpadních vod

biotechnologie - úvod Vývoj biotechnologií 3)Období penicilínové – 1928 – pol. 20.století Alexandr Fleming – objev antibiotické aktivity produktů některých plísní (Penilillium) fermentační výroba antibiotik 4)Období průmyslové mikrobiologie - 2. pol 20. stol. průmyslová biotechnologická výroba aminokyselin, enzymů, vitamínů, polysacharidů, alkaloidů, ethanolu do benzínu, bioplynu 5)Období genového inženýrství – konec 20. stol – dosud využívání mikroorganismů s upravenou genetickou informací

biotechnologie - úvod Význam biotechnologií 1)Výroba potravin a nápojů: tradiční oblast uplatnění biotechnologií, 75% všech biotechnologicky vyrobených produktů 2)Výroba přírodních látek:ty látky, u kterých je chemická syntéza drahá nebo není možná a izolace z přírodních materiálů nevýhodná 3)Zužitkování biologických odpadů: náhrada fosilních paliv, výroba krmných kvasnic 4)Čištění životního prostředí: likvidace biomasy, komunálních a průmyslových odpadů, sanace kontaminace

biotechnologie - úvod Základní pojmy Prokaryota/Eukaryota:baktérie/kvasinky Rod/druh/kmen: Saccharomyces/ S. cerevisiae/ S. cerevisiae var. Pragensis – kvasinka tolerantní k vyššímu obsahu alkoholu (25%) Kultivační médium: podle nároků mikroorganismu Inokulum: kultura mikroorganismů určená k zaočkování média Aerobní/anaerobní organismus: podle nároků na kyslík Autotrofní/heterotrofní organismus:podle nároků na výživu Fototrofní/chemotrofní organismus: podle zdroje energie Auxotrofní organismus/růstová látka: k růstu je třeba vybraná látka, kterou daný organismus neumí syntetizovat Limitace: omezení růstu nedostatkem některého prvku či látky Sterilita (aseptičnost): stav bez životaschopných organismů

biotechnologie - úvod Obecné schéma biotechnologického procesu Příprava surovin Příprava kultivačního média Příprava očkovacího materiálu Vlastní proces fermentace Získání produktu

biotechnologie - úvod Příprava surovin Zdroje uhlíku pro mikroorganismus jsou obvykle také hlavním zdrojem energie sacharidy:sacharóza, glukóza, fruktóza, laktóza, surový řepný cukr, škrob, celulóza sacharidická média:melasa, sladká syrovátka, celulózové substráty, sulfitové výluhy oleje a tuky:sójový, slunečnicový, palmový, řepkový, bavlníkový, sádlo petrochemické zdroje: uhlovodíky z ropy, syntetické alkoholy, organické kyseliny

biotechnologie - úvod Příprava surovin Zdroje dusíku Amonné soli:síran amonný (NH 4 ) 2 SO 4 rozpustný ve vodě, levný chlorid amonný NH 4 Cl fosforečnan amonný (NH 4 ) 3 PO 4 Amoniak:také pro úpravu pH fermentačního média Močovina:(NH 2 ) 2 CO Čisté aminokyseliny:často se používají také jako růstové látky Komplexní zdroje: kukuřičný výluh – odpad při výrobě kukuřičného škrobu šroty a mouky – odpady při výrobě olejů sušená syrovátka kvasničný autolyzát pro speciální účely nebo laboratorní práci, jsou drahé

biotechnologie - úvod Příprava surovin Zdroje fosforu fosfor je klíčový prvek v energetickém metabolismu a je tímto limitující pro růst Fosforečnany:fosforečnan amonný (NH 4 ) 3 PO 4 je také zdroj dusíku Komplexní zdrojekukuřičný výluh mouky a šroty masové, masokostní a rybí moučky Ostatní prvky a růstové látky Stopové prvky:anorganické soli Auxotrofie:potřeba různých složitějších organických sloučenin jako růstových látek (neschopnost jejich biosyntézy)

biotechnologie - úvod Příprava kultivačního média Obsahy jednotlivých složek kultivačního média jsou navrženy podle požadavků používaného mikroorganismu. Přesné složení média je sestaveno podle výsledků laboratorních pokusů a poloprovozních zkoušek. Médium je namícháno z vody a jednotlivých složek podle příslušné receptury (součást technologického reglementu). Před vlastní fermentací se fermentační médium a veškeré zařízení musí zbavit nežádoucích mikroorganismů. Sterilace:teplem – nejčastěji filtrací – vzduch chemicky nebo zářením – jen výjimečně

biotechnologie - úvod Příprava očkovacího materiálu Výběr vhodného produkčního kmene: na základě laboratorního výzkumu Šlechtění nebo genetická manipulace: k získání optimálních produkčních vlastností Inokulum: očkovací materiál

biotechnologie - úvod Vlastnosti průmyslového mikroorganismu: 1)Stabilita:existuje v čisté kultuře, je geneticky stabilní, má známé vlastnosti 2)Schopnost kultivace: je schopen rychlého růstu ve velkém měřítku, produkuje dostatečně životaschopné reprodukční jednotky 3)Bezpečnost: není patogenní pro lidi, zvířata ani rostliny, neprodukuje nežádoucí toxické produkty 4) Ekonomika: roste v levných médiích, nemá přehnané požadavky na růstové látky, produkuje požadovaný produkt v krátkém čase, vedlejší produkty tvoří jen omezeně nebo vůbec, lehce se odstraňuje z kultivačního média, produkt je lehce izolovatelný 5) Modifikovatelnost: schopný genetické manipulace, jeho metabolismus je dobře prozkoumaný

biotechnologie - úvod Způsoby získávání nových průmyslových mikroorganismů: 1)Screening – sběr z nejrůznějšího prostředí, izolace individuálních druhů, testování vhodnosti 2)Mutace již využívaných mikroorganismů - klasické metody: záření, chemická činidla vedou k změnám genetické informace v menším rozsahu 3)Genové manipulace: rozsáhlé změny genomu vnesením cizí genetické informace (i mezidruhově) vedoucí k podstatným změnám ve spektru produkovaných látek GRAS: generally recognised as safe – mikroorganismy považované za bezpečné, není třeba testovat jejich bezpečnost při standardním způsobu kultivace

biotechnologie - úvod Vlastní proces fermentace Bioreaktor – fermentor technické zařízení, ve kterém probíhá proces fermentace. Technické řešení zajišťuje biochemické inženýrství – spojuje konstrukční a chemické inženýrství s poznatky z mikrobiologie a biochemie. Konstrukce je podobná některým reaktorům používaným v chemické technologii. Velikost: jednotky litrů (laboratorní fermentory) až metry krychlové (čistírny odpadních vod) Materiál: sklo, nerezová ocel

biotechnologie - úvod Typy fermentorů dle fází –jednofázové (obsahují kapalný substrát s rozpuštěným enzymem) –dvoufázové (kapalina x mikroorganismy) –třífázové (plyn x kapalina x mikroorganismy) –čtyřfázové (tuhý substrát x plyn x kapalina x mikroorganismy) dle doplňování živin –vsádkové - jedno naplnění –semikontinuální –kontinuální - průběžné doplňování v průběhu fermentace dle aerace –aerobní –anaerobní dle aktivní složky –enzymové (mohou být volné nebo imobilizované, tedy uchycené) –mikrobní (volné, imobilizované)

biotechnologie-úvod Druhy produktů Biomasa nakultivované mikrobiální buňky Médium Kapalné médium modifikované činností mikroorganismů během fermentace Extracelulární produkt látka přirozeně produkovaná mikroorganismem a vyloučená vně buněk Intracelulární produkt produkt mikrobiálního metabolismu zůstávající po vzniku uvnitř buněk

biotechnologie - úvod Získání produktu Biomasa vypěstované buňky mikroorganismu (baktérie, řasy, kvasinky) Příklad: Saccharomyces cerevisiae: pekařské droždí, živé kvasinky pro další použití (výroba kvasného ethanolu, biotransformace) Kultivace: za podmínek ideálních pro dělení a růst buněk Oddělení buněk:sedimentace odstřeďování filtrace Další použití: v nativním stavu nebo po vysušení (krmné droždí, přídavek do krmiva)

biotechnologie - úvod Získání produktu Prokvašené médium Produktem je fermentovaná kapalina – původní kapalné médium Součásti média jsou pozměněné činností mikroorganismů, které v něm byly kultivovány a médium obsahuje produkty činnosti mikroorganismů. Příklad: výroba piva a vína – původní kapalný substrát (mladina, mošt) obsahuje ethanol vytvořený činností kvasinek Úprava: odstranění buněk mikroorganismu a nežádoucích zákalů (filtrace), případná úprava produktu (pasterace), stáčení do obalů

biotechnologie - úvod Získání produktu Extracelulární produkt Sloučenina, kterou mikroorganismus vytvoří ze složek média a vyloučí mimo svou buňku. Produkovaná látka je normální složkou metabolismu buňky, u produkčních kmenů je někdy produkována v mnohem větším množství (následek mutace, genetické manipulace). Produkt je z fermentovaného média izolován vhodnou metodou podle jeho vlastností (destilace, krystalizace, srážení). Příklad: kyselina citronová – plíseň Aspergillus niger, izolace srážením ve formě vápenaté soli kvasný ethanol – kvasinka Saccharomyces cerevisiae, izolace destilací

biotechnologie - úvod Získání produktu Intracelulární produkt Produkovaná látka zůstává v buňkách produkčního mikroorganismu. Izolaci látky musí předcházet šetrné rozbití buněk produkčního mikroorganismu (ultrazvuk, teplotní šok, povrchově aktivní látky, drcení s brusnými materiály). Vlastní izolace produktu dále probíhá různými separačními metodami – srážení, afinitní chromatografie. Izolační metoda nesmí poškodit vlastnosti izolované látky! Důležité zejména u bioaktivních látek (léčiva). Příklad: výroba karotenoidů, vitamínu D