Diagnostika vybraných skupin mikroorganismů Martina Sittová

Klinické aplikace metod molekulární mikrobiologické diagnostiky - výhody metody Kultivačně nezávislé - detekce a identifikace nekultivovatelných a obtížně kultivovatelných, usmrcených a poškozených mikroorganismů (M.tbc., chlamydie, borelie, viry) Vysoká citlivost (HCV, HBV, gonokoky, M.tbc) Rychlá detekce (M.tbc, meningitidy, sepse,..) Možnost vyšetřit jakékoliv klinické vzorky i bez ohledu na transportní podmínky Možnost kvantitativního provedení (HCV, HIV, HBV, CMV)

Klinické aplikace metod molekulární mikrobiologické diagnostiky – limity metody Problém standardizace metod rozdílné přístupy laboratoří v in-house technikách Použití standardizovaných komerčních kitů (CE-IVD) Klinická interpretace Někteří klinici metodu stále neznají a neumí používat metody jsou ve stadiu získávání poznatků k interpretaci výsledků nové vlastnosti metod (citlivost, nezávislost na kultivaci), mění pohled na infekci některými patogeny - borelie, „mrtvé patogeny“,…. Často není interpretační rámec např. pro vysokou citlivost metody Cena - při nesprávné indikaci vysoká Nízká informovanost kliniků – neznalost přínosu metody nebo až přehnaná očekávání „poškozují dobrou pověst“ těchto nových metod

Diagnostika mikroorganismů Pohlavně přenosné choroby – Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae genitální mykoplazmata/ureaplazmata Respirační infekce – Mycobacterium tuberculosis komplex, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Mycoplazma pneumoniae, Bordetella pertussis; Původci sepsí a generalizovaných mykóz – metody univerzální detekce bakterií a hub, detekce specifických bakterií a mikromycet (stafylokoky, streptokoky, meningokoky, aspergily, kvasinky rodu Candida apod.) Zoonózy, neuroinfekce, oční infekce – Borrelia burgdorferi s. lato, toxoplazma

Pohlavně přenosné choroby (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, HIV)

Chlamydia trachomatis Intracelulární patogen (při množení se uvolňuje) Jedna z nejběžnějších STD – CHT přítomny na sliznicích, ve spermatu, v moči Testování spermatu pro IVF Onemocnění: chronické infekce v oblasti pánevní, respirační infekce (děti), oční infekce Z krve se nediagnostikuje

Diagnostika CHT Průkaz antigenu, sérologické metod, kultivace se rutinně neprovádí PCR – zlatý standard

CHT PCR Klinický materiál: stěry z cervixu, uretry, rekta, rohovky, moč, sperma Kvalitativní detekce Cíl: kryptický plazmid (multikopiový cíl) a/nebo konzervativní úsek DNA genu 16S rDNA

RNA database project

Neisseria gonorrhoeae Kultivačně náročný aerobní diplokok Onemocnění – kapavka, faryngitida, tonsilitida

Diagnostika NG Kultivace Čokoládový agar popř. v kombinaci s antibiotiky pro určení citlivosti Výsledek možno odečíst po 24 hodinách, ale negativní lze konstatovat až po 48 hodinové kultivaci PCR Kvalitativní detekce 6 hodin

PCR NG Klinický materiál – moč, výtěr z uretry, rekta, cervixu, sperma Kvalitativní detekce Cíl detekce: 16S rDNA a/nebo PorA pseudogen, DR-9

Austrálie - rok 2011 V dubnu 2011 přijat na kliniku sexuálních chorob v Newcastlu mladý muž s análními bolestmi. Uvedeno několik sexuálních kontaktů s muži (MSM) Proveden odběr moči a dále faryngeální a rektální výtěr. Oboje odesláno na vyšetření N. gonorrhoeae:  Moč a rektální výtěr testovány pomocí analýzy nukleových kyselin  Stejný rektální výtěr testován kultivačně a izolát z kultivace dále analýzou nukleových kyselin Výsledek detekce byl znepokojující…

Detekční cíl Přímá repetice DR-9 POZITIVNÍ Detekční cíl porA pseudogen NEGATIVNÍ

Případ II Fenotypově byly izoláty z kultivace charakterizovány jako N. gonorrhoeae Byla provedena sekvenace úseku porA pseudogenu o délce 773 bp:

Případ II V úseku porA pseudogenu, do kterého je cílena většina systémů pro detekci N. gonorrhoeae nalezeny významné nukleotidové záměny Tyto změny v sekvenci vedly k falešně negativní detekci N. gonorrhoeae při použití PCR soupravy cílené do porA pseudogenu.

Borrelia burgdorferi spirálovité bakterie stavbou buněčné stěny podobná G- Přenáší se členovci Onemocnění: lymeská borrelióza Diagnostika BB: Kultivace, mikroskopie v zástinu, ELISA, western-blot Kvalitativní detekce pomocí PCR

BB PCR Klinický materiál: plná krev, mozkomíšní mok, moč, klíště, synoviální tekutina V průběhu onemocnění není mnoho period, kdy lze borélie v dostupném vzorku přímo prokázat. Je-li výsledek PCR pozitivní, je spolehlivým markerem boreliózy. Ke stanovení stádia onemocnění je nutná kombinace se stanovením protilátek v séru nebo likvoru. Kvalitativní detekce: včasný záchyt borélie před vznikem protilátek Cíl detekce: konzervativní úsek DNA genu 16S rDNA

kauzistiky Neuroborelióza: šestiletá dívka hospitalizovaná na počátku února pro parézu lícního nervu na interně v Boskovicích nervové příznaky a lehce zvýšené teploty serologie na neuroinfekce negativní kultivace a mikroskopie likvoru negativní PCR z likvoru, krve a moče - pozitivní jen v likvoru a moči - potvrzeno pozit. intratékálními protilátkami a Western-blotem dlouhodobá léčba ATB do úplného vymizení symptomů (latence nevyloučena)

Viry

Diagnostika virů Jakýkoliv virus Inaprentní infekce, latentní infekce, koinfekce (HPV+HIV) Vysoká mutační rychlost (RNA viry) Rutinně detekované viry - Herpetické viry – herpes simplex virus 1 a 2 (HSV1, HSV2), varicella – zoster virus (VZV), Epstein-Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV), lidský herpesvirus 6 (HHV6), lidský herpesvirus 7 (HHV7), lidský herpesvirus 8 (HHV8); parvovirus B19; Viry hepatitid – virus hepatitidy C (HCV), virus hepatitidy B (HBV); papilomavirus (HPV) + typizace „high risk“ skupiny; virus lidského imunodeficitu (HIV), typy 1, 2; lidský leukemický virus HTLV; virus chřipky H5N1 (varianta tzv. ptačí chřipky); Experimentálně detekované viry – enteroviry, adenoviry, BK virus, JC virus, SARS koronavirus, influenza, flaviviry (virus klíšťové encefalitidy, TBEV).

Virus hepatitidy typu C Obalený +ssRNA virus Obsahuje jediný gen kódující polyprotein Vysoká heterogenita Onemocnění – hepatitida, hepatocelulární karcinom, jaterní cirhóza Léčba – interferon alfa, ribavirin

Diagnostika HCV Založena na průkazu protilátek anti-HCV sérologickými metodami: ELISA, EIA, RIBA Průkaz RNA metodou reverzně transkripční PCR (kvalitativně-genotypizace a kvantitativně)

Diferenciální diagnostika v klinické mikrobiologii (Josef Scharfen, ml.)

HCV PCR Klinický materiál – plazma, sérum Kvalitativní stanovení HCV - genotypizace je přínosná pro optimalizaci terapie, její délky a při odhadu účinnosti léčby Kvantitativní stanovení-u pacientů s antivirovou léčbou cíl detekce: konzervativní úsek 5´UTR sekvence

Kvantitativní stanovení HCV ODPOVĚĎ V PRŮBĚHU TERAPIE rychlá virologická odpověď (RVR) – HCV RNA < 50 IU/ml ve 4. týdnu terapie parciální časná virologická odpověď (pEVR) – HCV RNA ve 4. i 12. týdnu terapie je >50 IU/ml, avšak s poklesem nejméně o 2 log 10 oproti výchozí virémii kompletní časná virologická odpověď (cEVR) – HCV RNA ve 4. týdnu > 50 IU/ml, ve 12. týdnu negativní rezistence na léčbu (non response, NR) – hladina HCV RNA se sníží ve 12. týdnu o méně než 2 log 10 oproti výchozí hodnotě

Odpověď na léčbu HCV Vitouš, A., Virová hepatitida typu C, diagnostika, terapie, prevence. Interní Med. 2010; 12(6): 339–342

Screening Dárci při transplantacích jsou plošně vyšetřováni na HCV Díky tomu došlo k snížení přenosu HCV z 5 % na 0 % Pooling – úspora peněz

Papilomaviry Malé neobalené dsDNA viry (55 nm) Druhová i tkáňová specificita (kožní a slizniční) DNA kóduje 8 proteinů časné fáze (E1-E8) a 2 proteiny pozdní fáze Asi 100 genotypů (více než 30 infikuje genitální trakt) Podle onkogenního potenciálu se dělí na high-risk a low- risk rizikové typy HPV Nejčastěji vyskytující se typ, který přispívá ke vzniku karcinomu děložního čípku, je HPV 16 a HPV 18 Onemocnění – bradavice, karcinom vulvy, vaginy, penisu, anální karcinom Léčba – operace, Isoprinosine

Papilomaviry High risk HPV jsou schopny iniciovat neoplastickou transformaci buněk Dochází k začlenění virového genomu do DNA hostitelské buňky a produkci onkoproteinů E6 a E7 Vazba proteinu E6 na p53 označí p53 pro degradaci via ubiqitin a tím způsobí ztrátu kontroly buněčné proliferace a destabilizaci genomu

Diagnostika HPV Klinický materiál: stěry Morfologické metody (cytologie, histologie) umožňují zjistit subklinickou formu infekce. Histologie klasifikuje změny v bioptickém materiálu a je definitivním potvrzením diagnózy. Hybrid capture II system (Digine)-hybridizace DNA HPV spolu s typově specifickými RNA sondami Detekce DNA pomocí PCR – až 95 % a více pravděpodobnost včasného záchytu karcinomu cervixu (oproti 70% v případě použití pouze cytologie)

Vakcinace HPV Plošná vakcinace proti HPV např. v Austrálii (dívky i chlapci) Silgard – vakcinace proti HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18 Cervarix – vakcinace proti HPV 16 a HPV 18 Zkřížená ochrana proti HPV 31, 33 a 45

Houby

Aspergillus spp. Vláknitá, kosmopolitní všudypřítomná plíseň Houbové infekční onemocnění – invazivní aspergilóza u imunokompromitovaných pacientů Diagnostika: stanovení přítomnosti galaktomananu (ELISA), mikroskopie, kultivace, RTG plic PCR – 18S rDNA, mtDNA

Antibiotická rezistence

Přirozená (primární) Vrozená necitlivost bakteri k danému antibiotiku Důvodem je absence cíle antimikrobiální látky Získaná (sekunádrní) Genetická modifikace genu na chromozomu Převzetím genetického materiálu od jiných mikroorganismů (plasmidy, transpozony, aj.)

Antibiotická rezistence Akademická půda a referenční laboratoře Diagnostické laboratoře ve velkých nemocnicích Nový nástroj pro detekci bakteriální rezistence

MRSA Rezistence k methicilinu Stafylokoková chromozomová kazeta (SCCmec) – v současné době 11 typů Gen mecA a mecC Pozměněný PBP2 protein (penicilin-binding protein)

MRSA PCR Kity Molekulární diagnostika – kolonizace MRSA na nosní sliznici RIDA GENE MRSA (r-biopharm) Microbial DNA qPCR Multi-Assay Kit MRSA (Qiagen) LightCycler MRSA Advanced test (Roche)

VRE Rezistence k vankomycinu u E. faecalis a E. faecium Geny vanA, vanB – vanG (7 typů rezistencí) transpozon

VRE Molekulární diagnostika – rektální stěry pro screening VRE u hematoonkologických pacientů Seeplex VRE detection Kit (Seegene) LightCycler VRE research use only detection kit

ESBL Extended spectrum beta-lactamases Enterobacteriaceae – K. pneumoniae, E. coli rezistence k penicilinům, cefalosporinům všech generací a monobaktamům TEM, SHV, CTX-M, OXA plazmid

Genetika beta-laktamáz typu SHV a CTX-M SHVCTX-M CTX-M – CTX-M + SHV-1 SHV-ESBL GGC AGC G/A

ESBL Molekulární diagnostika – konfirmační testy z ESBL pozitivních kultur, rychlé testy u pacientů v ohrožení života Hyplex ESBL ID (amplex) Check – direct ESBL (Check points)

Karbapenemázy a metalo-β-laktamázy Serinová karbapenemáza typu KPC Metalo-β-laktamázy typu NDM-1, VIM, IMP (první v Česku v roce 2008) OXA-48 AmpC Plazmidy, transpozony, integrony

Karbapenemázy a metalo-β-laktamázy Molekulární diagnostika – verifikace kultivace, test přímo z relevantního klinického materiálu Amplisens MDR PCR Kit (Amplisens) Check-MDR Carba (Check-points) Hyplex SuperBug ID (amplex)

Multirezistentní M. tuberculosis Isoniasid, rifampicin, streptomycin, pyrazinamid, ethambutol isoniasidu Rezistence k isoniasidu – mutace v genu KatG (gen pro kataláz-peroxidázu) rifampicinu Rezistence k rifampicinu – mutace v genu rpoB (kóduje β pojednotku RNA polymerázy)

M. tuberculosis Molekulární diagnostika – u mimoplicních forem, u forem s atypickým průběhem (u dětí, HIV+) V současné době už se plošně neočkuje Kalmetizační centra Tuberculosis Drug Resistance Detection Array Kit (CapitalBio corporation) Xpert ® MTB/RIF (Cepheid)

Detekce pouze genotypu ne fenotypu Detekce pouze částečného genu Gen se nemusí exprimovat Mutace v genech pro rezistenci Lokální prevalence Rychlé nasazení adekvátní antibiotické terapie Schopnost sledování epidemiologie Léčba nemůže být založena pouze na výsledku z molekulárně biologických metod Shrnutí molekulární detekce antibiotické rezistence

Vyléčený pacient Fenotypové a sérologické metody Molekulární diagnostika