Suspenzní populace rostlinných buněk Rostlinný explantát callus Amorfní buněčná konsorcia Suspenzní buněčná populace Kultivace Testy znakové aktivity Testy stability znakové aktivity Znaková aktivita vs buněčná diferenciace Manipulace a podmínky vs buněčná dediferenciace Kultivační podmínky vs buněčná dediferenciace ? Apl. biologie rostlinné buňky

Kompozice kultivačního prostředí Individuální variace zdroj C prekursory produktu specifická aditiva

Aparát biosyntézy sekundárního metabolitu….. „metabolické inženýrství“ ● dráha biosyntézy „flux“ ● buněčná lokalizace biosyntézy ● lokální limitace rychlosti biosyntézy ● kompetitivní dráhy ● regulace genového vyjádření ● stav buněčné populace

Sekundární metabolity (Albrecht Kossel, 1891) Funkce: efektoru faktoru (ekologické) selektivní výhody deponovatelná / odpadní forma produktu primárního metabolismu Produkce: vs buněčná diferenciace životní cyklus (stárnutí) růstové podmínky buněčná imobilizace Inter-organismální interakce Buněčná odpověď ----elicitace …biotické / abiotické elicitory (fytoalexiny) Klasifikace (rostlinných) sekundárních metabolitů ● hledisko funkce a strukturní příbuznosti Alkaloidy (bazické heterocykly - minimálně jeden atom dusíku) např. pyridiny, piperidiny, pyrrolidiny, tropany, isochinoliny, indoly, xantiny steroidní heterocykly Barviva flavonoidy, karotenoidy, chlorofyl Aromatické sloučeniny různě oxidované a substituované fenoly a chinony (kondensované struktury / konjugáty)

Rostlinná buňka - biologický činitel technologie (požadavky) ● stabilita genotypu / fenotypu znaky : buněčný tvar, buněčná agregace buněčná citlivost stav buněčné diferenciace fotosyntetická atrofie produkční aktivita (vztah produkční a růstové fáze) mikropropagace / makropropagace Reprodukovatelnost buněčné odpovědi P 1, P 2 : sledované produkty LR – BL : limitovaný růst BL : identifikace buněčné lyze

Apl. biologie živočišné buňky Buněčné kultury – základní příprava ■ enzymové / mechanické rozvolnění izolované tkáně kolagenasa (ex Clostridium histolyticum - „cell culture tested“, sterile-filtered version) ● redukce celkového počtu buněk schopných reprodukce ● tekuté medium: sole, AK, bílkoviny, Fe ● přítomnost vitálního buněčného typu vitaminy, glukóza, osmotická stabilizace, ● ztráta orgánové specifity aseptické podmínky, statická kultivace, ● typ a stáří výchozí tkáně neutrální pH,.. 37 O C ● příprava primární kultury ● kultivace

„Anchorage dependent cells ● makropórezní mikronosiče - povrchy dutých vláken - „3D“ kultury ● redukce střižných sil ● poměr objemu kultivovaných buněk / objemu media „scaffold“ ● „cell detachment“ ● buněčná permeabilizace Cytodex ®

Buněčné linie Primární suspenzní kultura Diploidní buněčná linie Heteroploidní buněčná linie ● nelimitovaný buněčný potenciál (immortalised cell lines) ● růstový cyklus ● saturační hustota ● dokumentace - standardizace - „cell banking“

Interferony ● indukce stavu resistence živočišné buňky k virové infekci ● INF – primárně produkt živočišné buňky (glykoprotein) ● typové rozlišení: IFN – α / α – Interferon ( 20 subtypů ) IFN - β / β – Interferon ( 2 subtypy ) IFN - γ / γ – Interferon ( 3 subtypy ) Typ II ● produkující buněčný typ: IFN – α ( více buněčných typů - leukocyty ); INF–ω, τ (α-2-typ ) IFN - β ( fibroblasty, makrofág, B - lymfocyty ) IFN - γ ( T – lymfocyty, NK ) ● vlastnosti: IFN – α ( pH 2 – stabilní; 16 – 26 kDa; hydrofóbní ) IFN - β ( pH 2 – stabilní; kDa; hydrofóbní ) IFN - γ ( pH 2 – nestabilní; 50 kDa; hydrofilní ) ● druhově specifické proteiny ● Typ INF vs induktor syntézy – typ produkující buňky Typ III (λ) Typ I

● mimobuněčné uvolňování (cytokiny: interleukiny, interferony, chemokiny, růstové faktory, faktory nekrotizující nádory) ● nespecifický anti-virový efekt ● indukovaná syntéza (ds RNA, syntetické polynukleotidy, bakteriální taxony, chemikálie, polymerní částice…antigeny) ● INFs jsou syntetizovány jako „navigované“ proteiny INF – α INF - β

Virová infekce vs nespecifiká (interferonová) a specifická (protilátky) imunitní odpověď

Produkující a aktivovaná buňka (anti-virový efekt INF) Společný typ receptoru pro INF – α, β

Proteiny anti-virové pohotovosti

● ne-antivirové účinky interferonů: funkce imunitního systému buněčná proliferace profil enzymové aktivity struktury buněčného povrchu (mnohočetný biologický účinek - více jak 30 genových produktů je pod vlivem IFN) ● vedlejší účinky klinických aplikací: autoimunitní reakce neurotoxicita kardiotoxicita ● Problematika klinických aplikací ● Použitelný preparát IRF – interferonem regulovaný faktor ISGF – interferonem stimulovaný růstový faktor ISRE – interferonem stimulovaný respondentní element TECHNOLOGIE vs experimentálně / klinicky použitelný preparát

Monoklonální protilátky Adaptivní (specifická) imunita - - Monoklonální protilátky ● nespecifická imunita - - (obecně fungující obranné mechanismy, neovlivněné předchozím kontaktem s imunogenem) ● specifická imunita - - ( získaná imunita, předchozí kontakt s imunogenem, paměť, imunitní odpověď)

► Imunogen = antigen (induktor imunitní odpovědi ) ► Epitop = antigenní determinant (nejmenší oblast antigenu schopná vázat protilátku) HI (humorální / protilátky) ► Specifická imunitní odpověď CMI (cell mediated immunity) – buněčná imunita ► Imunogen vs imunitní odpověď: bakterie (HI), viry (CMI), kvasinky(HI), prvoci (HI), vláknité houby (CMI), transplantáty (CMI), makromolekuly (HI) ► poměr HI / CMI

► buňky specifické imunitní odpovědi: T - lymfocyty ( T h, T c, T m ) B - lymfocyty antigen prezentující buńky (APCs) APC MΦ TcTc

Vývoj specifické imunitní odpovědi Humorální imunitaBuněčná imunita

Imunogen – např. bakt. buňka

Imunogen virová částice

Interleukiny (IL)– regulačně aktivní peptidy (podskupina lymfokinů) - modulátory s proliferačním a diferenciačním signálem „lokální“ hormony IL-3: stimulace kostní dřeně IL-4: stimulace T-, B- lymfocytů IL-5 stimulace B-lymfocytů IL-6: stimulace plasmastických buněk IL-7: stimulace APCs INF-γ stimulace makrofágů

Humorální imunita - protilátky V C -S-S-

Variabilita epitopů vs specifita protilátky (10 6 – 10 9 možných vazebných variant protilátek) Úroveň kmenové buňky

Komplement

Sekvenční aktivace bílkovin komplementu

Monoklonální protilátky César Milstein, Georges Köhler, Niels Jerme (1975), 1984 HGPRT - HGPRT + hypoxantin-guanin-fosforibosyl trnasferasa HAT medium (hypoxantin, aminopterin, thymin)

■ detekce: léčiv, toxinů, hormonů, sérovým proteinům, markerů tumorů proteinů cytoskeletu….protilátek ■ radioimunodetekce / radioimunoterapie …cílená navigace léčiv ■ molekulová diagnostika pathogenů ■ antivirové preparáty ■ experimentální práce - diagnostika Aplikace monoklonálních protilátek

Vakcíny Typy vakcin - princip přípravy ► virulentní organismus musí být „produkovatelný“ ► použitelná množství ► virulentní organismus nesmí být součástí vakciny ► avirulentní stav musí být nevratný ► stabilta / skladování ► vedlejší účinky vakcinace…. aplikace

Inaktivace infekčního agens ■ nevratný zásah biostatického / biocidního prostředku ■ první dávka indukuje humorální imunitu ■ vývoj imunitní paměti ■ 2. – 3. dávka → vývoj protekce (humorální imunita) Nevratná ztráta reprodukční aktivity Alternativně: toxin → toxoid „toxoidní vakciny“

Atenuace infekčního agens ■ nevratná ztráta virulence při zachování reprodukční aktivity infekčního agens ■ obecně silnější imunogenicita preparátu ■ komplexní imunitní odpověď - stabilita získané imunity ■ možná změna genotypu atenuovaného infekčního agens

Hepatitis B virus HBsAg povrchový antigen ■ multi - subjednotkové vakciny Redukce infekčního agens - subjednotkové ( komponentové ) vakciny ■ redukce virulentního imunogenu na vybrané epitopy ■ desintegrace imunogenu ■ manipulace genového inženýrství ■ 100 % avirulence vakciny

DNA vakciny ■ imunizace fragmentem DNA determinujícím klíčový epitop „terapeutické vakciny“

Bioinsekticidy ► vs chemický prostředek ► vs cílový taxon hmyzu ► entomopatogenita mikroorganismů a virů buněčná reprodukce virová infekce intoxikace ► zdroj entomopatogenu vs přirozena biologická kontrola výskytu hmyzu ► riziková toxicita entomopatogenu ► sporogenní druhy rodu Bacillus vs entomopatogenní houby a prvoci

Bacillus thurigiensis (Bt) (1901) ■ fakultativně anaerobní taxon, g + ■ genomová identita s Bacillus cereus ■ asi 71 sérotypů / 84 ssp ■ sporogenní ■ parasporální krystalické inkluze (tvarová variabilta) ■ insekticidní krystalický protein (ICP) ■ vztah mezi morfologií inkluze, typem ICP a bioaktivitou ■ β – exotoxin ■ cry a cyt geny nomenklatura

Mechanismus biologického účinku ICP (Bt toxicita)

Entomopatogenní viry Baculoviridae

Imobilizace enzymů a buněk ■ termín „imobilizace“ vs biologický materiál ■ význam „umělé imobilizace“ biologického materiálu ■ imobilizace enzymů ■ změny indukované imobilizací ■ charakterizace imobilizovaného biokatalyzátoru

Metodologie imobilizace proteinů A B C Kombinace A : B : C „enkapsulace“ A - imobilizace využívající povrch nosiče B - bez použití nosiče C - zabudování / uzavření Volba metody – základní znaky metody - preferované techniky

Imobilizace buněk ■ důvody (vs imobilizace proteinů) ■ buněčný typ / intaktní stav buňky ■ fyziologický stav buňky před a po imobilizaci ■ metody imobilizace ■ význam zachování buněčné reprodukce ■ často frekventované metody vs imobilizace proteinů ■ umělá vs přirozená imobilizace buněk ■ buněčné upoutání kovalentní vazbou ■ společné rysy imobilizace proteinů a buněk

Použitelnost kovalentní vazby Carrier epoxide derivative spacer arm NH 2 CHO monomeric dialdehyde Activated carrier CHO modified by cell attachment NH 2

Lipozomy Cílená příprava membránových vesikulů – liposomů „umělé“ buněčné kompartmenty vs syntetická biologie buněčná minimalizace ….použitelnost přirozeného biologického komponentu Znaková biochemická aktivita …závislost na transportu a energii reprodukce ? liposom ….prostředek enkapsulace (Bangham, Horne, 1964) multilamelární multivesikulární

Aditivní modifikace povrchu liposomu

Typ a lokolizace ingredientů

Indukovaná fuze liposomů

Metodologie přípravy

Biologická fixace N 2 N H + + nMg ATP → 2 NH H 2 + nADP + nPi (n ˃ 16) Komplex nitrogenasy ■ inhibován O 2 (anaerobní podmínky, protekce) ■ obsahuje: molybdoferredoxin (komponent I, MoFe protein, „nitrogenasa“ azoferredoxin (komponent II, Fe protein, „reduktasa nitrogenasy) ■ molybdoferredoxin: α 2 β 2 tetramer ( 2Mo a Fe 7 S 8 centra) azoferredoxin: dimer identických subjednotek (Fe 4 S 4 centrum) ATP ■ 2-5% z celkového obsahu proteinů ■ redukující aktivita vs širší spektrum substrátů nitrogenasa

Klebsiella pneumonie nif regulon Q B A L F W M V S U X N E Y K D H J Fe protein MoFe protein (azoferredoxin) (molybdoferredoxin) nif B,E,V,W,Z determinace syntézy MoFe kofaktoru nif Y inzerce MoFe kofaktoru nif U, S biosyntéza metalo-center nif X neznámá funkce nif Q Mo (transport) nif A, L, C regulační bílkoviny p

Rhizobium / Bradyrhizobium proces nodulace Stav „bakteroidu“

Mnohobuněčné konstrukty mikroorganizmů Společné znaky: Spontánní vznik Kolektivní systém Funkční diferenciace Mimobuněčná regulace Variabilita architektury Mechano-fyziologické interakce (buněčné kolonie, buněčné agregáty) přirozené biofilmy

Kompozice přirozeného biofilmu, určující faktory Uvolňování buněčné složky

Biologická individualita – zastoupení taxonů, interakce subpopulací Vztahy subpopulací – závislost na kontaktu,závislost časová, metabolická,horizontální přenos genetické informace Úloha EPS – prostorová distribuce, stabilita a rezistence, difusní bariéra, biosorpce, stav hydratace Mezibuněčná signalizace Faktory ovlivňující stav a funkci biofilmu

Bioremediace Bioremediace – zásah in- situ, ex-situ Perzistentní polutant Komplexní polutant Dostupnost polutantu (bioavailability) Toxicita polutantu / toxicita prostředí Nutriční závislost biodegradace Autochtonní mikrobiota vs technologická Celková znalost kontaminovaného prostředí

Účinnost bioremediace (biodegradace) je vždy určena: a)metabolickým potenciálem působícího mikroorganismu(ů); b) jeho fyziologickou adaptabilitou; c) jeho reprodukční aktivitou; d) přítomnými induktory sporogeneze e) citlivostí mikroorganismu k působení stresorů cílového prostředí; f) profilem a variabilitou ostatních nutrientů; g) citlivostí k nutriční deficienci; h) citlivostí k cytotoxickému působení odbourávaného polutantu, včetně intermediátů jeho degradace; ch) citlivostí ke stresorům prostředí;

i) stavem a adaptabilitou struktur buněčného povrchu j) mezibuněčnými interakcemi k) změnou zastoupení taxonů biodegradérů l) schopností kolonizovat povrchy prostředí (vznikem biofilmu) m) remediační účinností biofilmu