BIOTECHNOLOGIE Rostlinná biotechnologie Živočišná biotechnologie Historie: tradiční kvasné procesy - fermentace Rostlinná biotechnologie Živočišná biotechnologie Biotechnologie životního prostředí Biotechnologie enzymů Mikrobiální a buněčná biotechnologie Vývoj diagnostik, farmaceutik Obecná biotechnologie Ludmila (Mělník) GFP transgenic mouse (Nagy) Podle využití: Potravinářská biotechnologie Obnovitelné zdroje Bioremediace (odstranění znečištění) Farmaceutická biotechnologie

Biotechnologická výroba Biotechnologické postupy místo pracné izolace z přírodních surovin nebo místo chemických syntéz. Výhody: selektivita, požadovaná optická aktivita, méně toxické meziprodukty GM bakterie: kyselina glutamová – ochucovadlo GM bakterie: dipeptid aspartam – sladidlo GM houba Aspergillus niger: org. kyseliny (citronová, glukonová) a další: polysacharidy, vitaminy, aminokyseliny,peptidy Semisyntetická výroba: deriváty námelových alkaloidů a steroidních hormonů Historie výroby a aplikace indiga: po několik tisíciletí bylo indigo získáváno z rostlin (Isatis tinctoria, Indigofera tinctoria,) před barvením tkanin redukováno na leukoformu fermentací za přítomnosti bakterie Clostridium isatidis. Od konce 19. století chemická cesta. V posledních letech - bio-indigo rostlinného původu, +bakteriální kmeny pro jeho redukci Nově nalezena mikrobiální cesta biosyntézy indiga transformovanou bakterií Escherichia coli.

→výroba estrogenů, progesteronů, androgenů, kortikosteroidů Semisyntetická produkce: deriváty Claviceps purpurea, steroidní hormony… Kortikosteroidy a Dioscorea (jamy) 1950: Nobelova cena za fyziologii and medicinu- Kendall a Hench : Léčba zánětlivých onemocnění (artritidy…) kortizonem. Získávání: ze žluči 40 dobytčat (+40 dalších kroků): 1 dávka kortizonu 1g za 1000 USD Příkaz presidenta Trumana: testy 5000 rostlin: Strophanthus sarmentosus (používán v Africe na trachom, artritidu… Stará mexická lidová medicína: Divoké jamy, Dioscorea mexicana : V hlízách o váze až 100kg.. až 5% diosgeninu →výroba estrogenů, progesteronů, androgenů, kortikosteroidů Dnes značná část synteticky, ale i z tkáňových kultur Dioscorea

Produkty biotechnologie mikroskopických řas a sinic Polynenasycené mastné kyseliny (ω-3 PUFA, ω-6 PUFA) s příznivými účinky na nervový i oběhový systém, např. DHA (dokosanhexaenová) a EPA (eikosapentaenová kyselina) lze získat z mořských řas (Schizochytrium sp., Crypthecodinium cohnii) I mořské ryby mají jako zdroj PUFA řasy, bioakumulací obsah roste. Jiné příklady biotechnologie řas a sinic pro farmacii: Crypthecodinium DHA vývoj mozku Odontella EPA protizánětlivá Spirulina Vitamin B12 posílení imunity Ulkenia DHA léčba duševních poruch, srdce.. Hobby i vědecký výzkum posledních let: Biopalivo z řas http://www.instructables.com/id/An-Algae-Bioreactor-from-Recycled-Water-Bottles

Buněčné kultury – rostlinné explantáty (často kalusové) ROSTLINY: Buněčné kultury – rostlinné explantáty (často kalusové) Nemodifikované rostlinné buněčné kultury: v závislosti na volbě kultivačních podmínek produkují vybrané sekundární metabolity účinněji než vlastní intaktní rostliny 1983: průmyslová produkce šikoninu suspenzními kulturami kamejky rudokořenné Lithospermum erythrorhizon:, in vitro produkovaný šikonin se používá v kosmetice, potenciální NSAIDS Transgenní buněčné kultury mohou produkovat metabolity zcela jiné, než původní rostlina. První vakcína produkovaná rostlinnými buněčnými kulturami USA 2006 –proti newcastleské chorobě drůbeže (z kultury GM tabáku) Totipotence rostlinných buněk (u savců jen kmenové nebo embryonální): Z transgenní buněčné kultury lze regenerovat celé rostliny!

Transgenní rostliny – cizí geny Jiná možnost GMO-cisgenní rostliny Do rostlin jsou vnášeny vlastní strukturní geny (kódují syntézu specifické bílkoviny) případně regulační sekvence Cisgenní - přenos genů vlastních stejnému rostlinnému druhu nebo blízce příbuzným…tj. urychlené šlechtění ALE: Uměle navozené mutace nejsou regulovány! (trpasličí řepka z metageneze) Tradiční křížení: genotyp vysokoprodukční  odrůdy smíšen s genotypem včetně nežádoucích genů- zdlouhavé došlechťování (př. strupovitost jablek: Po odstranění horší chuť. Nevoňavé růže…) Jinak běžná nebezpečí GM: ovlivnění okolních genů, mutace, polyploidie… GM u zvířat-totipotentní embryonální buňky. Vnášení cizí DNA: mikroinjekce DNA do prvojádra pomocí upravených retrovirů. křížení In silico

GMM = genetically modifikovaný mikroorganismus Cartagenský protokol o biologické bezpečnosti (GMO): 1999 Cartagena, 2000 Montreal Základní dokument o nakládání s živými modifikovanými organismy - GMO Princip předběžné opatrnosti ( článek 15 Úmluvy o biodiverzitě (z Ria 1992) Má se podle možnosti aplikovat tam, kde hrozí závažné nevratné poškození, i když chybí vědecká jistota Pravidla pro přeshraniční převoz, tranzit a užití všech GMO které mohou mít nepříznivé účinky na zachování a udržitelné využívání biologické rozmanitosti: Balení a označování, hodnocení rizik, oznámení, informační systém (Biosafety Clearing –House) GMM = genetically modifikovaný mikroorganismus

Glo-fish GM Danio (zebřičky) Co jsou a co nejsou geneticky modifikované organismy ZÁKON 78/2004 Sb. ze dne 22. ledna 2004 o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty  GMO vzniknou:  technikou rekombinantní nukleové kyseliny (vložením úseku nukleové kyseliny připravené mimo organismus do viru, plasmidu nebo jiného vektorového systému a jeho začleněním do organismu příjemce, ve kterém se normálně nevyskytuje, ale ve kterém je schopen dalšího množení, technikou zavádějící dědičný materiál připravený mimo organismus přímo do organismu příjemce (mikroinjekce, makroinjekce, biolistické metody, mikroenkapsulace, umělé chromosomy technikou buněčné fúze dvou nebo několika buněk -vzniknou životaschopné buňky s novou kombinací dědičného materiálu, a to metodami nebo prostředky, které se nevyskytují přirozeně Glo-fish GM Danio (zebřičky) +geny z medúzy, korálu… made in Singapore V Evropě nelegální http://en.wikipedia.org/wiki/File:GloFish.jpg

Transformační mechanismus: často s využitím bakteriálních buněk 1976 R. A. Swanson , H. W. Boyer – zakladatelé (1973) rekombinantní DNA technologie a firmy Genentech (Genetic Engineering Technology, Inc.), : Plasmid = extra-chromosomální DNA u bakterií často využívaná v GE Restrikční enzymy „vystřihnou“ požadovaný fragment DNA a vloží ho do upraveného plasmidu oblast pro vložení DNA reprodukce Postup je samozřejmě velmi složitý, transkripční mechanismus prokaryotických a eukaryotických buněk se liší… GM DNA i plasmidy lze koupit! plasmid jako vektor resistence

Modifikovaný adenovirus jako vektor Další možnosti vložení „ genového konstruktu“ do eukaryotických buněk (negat. nabitá DNA musí překonat negat. nabitou buněčnou membránu): TRANSFEKCE: Modifikovaný adenovirus jako vektor

Nejobvyklejší modifikace rostlin: a) HT =Roundup-resistant = tolerantní k širokospektrálním herbicidům, které zahubí jen plevel: Roundup-ready sója… b) Bt modifikace (Bt kukuřice) Rostlina produkuje transgenní endotoxin (z Bacillus thuringiensis) proti larvám hmyzu

1) Detekce: Reportérové geny (kontrola úspěšnosti – výtěžku) Obvykle se vkládají s cílovými geny (kódujícími požadovanou schopnost – např. syntézy enzymu) další geny: Úspěšně transformované buňky je nutno odlišit od nezměněných: – detekovat (reportérové geny) a separovat (markerové geny) Případně další: promotory, terminátorové geny…) 1) Detekce: Reportérové geny (kontrola úspěšnosti – výtěžku) přidávají buňkám snadno měřitelnou vlastnost, například fluorescenci gen zeleně fluoreskujícího proteinu (GFP, z medúzy Aequorea victoria) NOBELOVA CENA 2008 Roger Y Tsien. Jiné: snadno detekovatelné enzymy (CAT, GUS) luc-genes (lucipherase producing) Dobrá zpráva z října 2010: 'VIRIMAGING' Norman Maitland (Yorkshire Cancer Research Laboratory) GFP lze vnést pomocí viru do rakovinných buněk: včasná detekce (luminiscence) nádorů (pomocí speciální kamery)

a to u všech inovací v zemědělství. 2) Markerové geny (vnášejí odolnost vůči antibiotikům, např. gen nptII proti neomycinu : Funkce: selekce transformovaných buněk od ostatních ABR (antibiotic resistence) geny pomáhají separovat GM-non GM: GM (ABR) buňky přežijí Hlavní důvod odmítání GMO: Teoretická možnost indukce ABR (rezistence vůči antibiotikům) u lidských, zvířecích či rostlinných patogenů Naši vědci většinou podporují rozvoj biotechnologií a jejich aplikací: Vydali v době českého předsednictví EU Bílou knihu biotechnologií (Biol.centrum AV ČR) (osvěta a propagace, příklady) „klasické zemědělství poškozuje díky chemii životní prostředí více než GMO“, má se posuzovat výsledek šlechtění, ne cesta Princip předběžné opatrnosti by měl být nahrazen solidním a spolehlivým posouzením přínosů a rizik a to u všech inovací v zemědělství. Model Zephyris

Amflora Amylopectin Potato Po několik let bránil Evropský komisař pro životní prostředí (Dimas) uvolnění pěstování GM brambor kvůli ABR genu. V březnu 2010 povoleno. Amflora Amylopectin Potato EH92-527-1 (BASF) Testováno v ČR, 2010 oseto 150ha Amflora konvenční Jen pro technické účely a jako krmivo NE jako potravina Redukovaný obsah amylózy (výhodné pro technické použití: plnivo do papíru, stavebních hmot…) : Lugolův roztok dává slabší modré zbarvení - méně komplexů amylózy s [ I3 ]- http://www.basf.com/group/corporate/en/function/conversions:/publish/content/products-and-industries/biotechnology/images/Amflora_User_Guide.pdf

Podstatná část biotechnologických oborů je založena na činnosti mikroorganismů Ve farmacii produkce antibiotik, vitaminů, enzymů, hormonů, alkaloidů… Producenti:kvasinky (zejména rod Saccharomyces), houby (Aspergillus, Penicillium, Claviceps a další) bakterie (Streptomyces, Escherichia, Pseudomonas) Specializované kmeny:„průmyslové“ mikroorganismy – se získají šlechtěním, selekcí, mutacemi přirozenými i umělými, transgenezí: Bioreaktor Photo: Applikon Už před nástupem genového inženýrství byly při získávání organismů se změněnými vlastnostmi využívány, případně navozovány změny jejich genetického materiálu (mutace spontánní nebo indukované). Funkce mikroorganismů v biotechnologii: přímí producenti: (Escherichia coli nebo Saccharomyces cerevisiae tvoří lidský inzulin, houby produkují také β-karoten, vitaminy E.F b) zdroj enzymů- fermentační procesy: ergosterol -provitamin D2, riboflavin (B2), cyanokobalamin (B12), kys. lipoová (B13), ATP, koenzymy…

Chymosin (rennin) =syřidlo, proteáza (nelze nahradit -specifický způsob štěpení): dříve z telecích žaludků, dnes pomocí tří  různých typů mikroorganismů do kterých byl vnesen gen zodpovědný za jeho tvorbu (gen získán z mRNA izolované z mukózy telecích žaludků). 1.GM bakterie Escherichia coli → Chymax (Pfitzer), 2. GM kvasinky Kluyveromyces lactis → Maxiren (DSM) 3. GM plísně Aspergillus niger var. awamori → Chymogen (Genencor Všechny fungují jako přírodní chymosin. Lze vyrobit s obsahem účinné látky až 90 % (přírodní 4-8 %). MAXIREN-   chymosin - Kluyveromyces lactis  (Saccharomacetes) -  Kosher-Halal deklarace!

o uzavřeném používání GMM Řada GM enzymů je registrována: až v 90% potravin v supermarketech mohou být použity: pivo, víno, olej, ovoce, cukr, mléčné výrobky, pečivo… celkem trh 1,3 miliardy dolarů (hlavně. Novo Nordisk) Některé z enzymů vyráběných GE (ze seznamu FDA): Novamyl(TM)— pečivo-uchovává čerstvé Alpha amylase— cukr, maltodextriny, sladidla Pullulanase— fruktózový sirup GMM jsou v pozadí GMM v potravinářství a řadě dalších výrobků: produkují žádaný enzym v uzavřených fermentačních kontainerech Separace: výsledný enzym neobsahuje žádný GMM Směrnice 98/81 o uzavřeném používání GMM 90/219/EC Foto: Novozymes

Seznam Novozymes' enzymů produkovaných GMM Food Applications: Amylase® AG XXL Glucoamylase Juice Industry Attenuzyme® Glucoamylase Brewing Industry Biocip® Membrane Glucoamylase / Polygalacturonase / Cellulase Juice Industry Ceremix® Plus Alpha-amylase / Protease / Betaglucanase Brewing industry Cerezyme Sorghum® Alpha-amylase / Protease / Betaglucanase Brewing industry Dextrozyme® Pullulanase / Amyloglucosidase Starch industry Finizym® W Phospholipase Starch industry Fungamyl® Super MA Alpha-amylase / Xylanase Baking industry Gluzyme® Mono Glucose oxidase Baking industry Lecitase® Novo Lipase Oils and fats industry Lecitase® Ultra Lipase Oils and fats industry Lipopan® Lipase Baking industry Lipozyme® Lipase Oils and fats industry Liquozyme® Alpha-amylase Starch industry Maltogenase® Maltogenic amylase Starch industry Maturex® Alpha-acetodecarboxylase Brewing industry Novamyl® Maltogenic amylase Baking industry Noopazyme® Lipase Pasta / Noodles NovoCarne® Tender Protease Meat industry Novoshape® Pectinesterase Fruit processing Novozym® 27080 Carbohydrase / Lipase Baking industry NOVOZYM® 27122 Xylanase Protein Hydrolysis Novozym® 33081 Polygalacturonase Juice Industry Novozym® 37020 Protease Meat industry Novozym® 46016 Phospholipase Dairy industry Novozym® 46019 Cellobiose oxidase Dairy Industry Palatase® Lipase Dairy industry Pectinex® XXL Pectin lyase / Polygalacturonase Juice Industry Pectinex® BE XXL Pectin lyase Juice Industry Pectinex® SMASH XXL Pectin lyase Juice Industry Pectinex® YieldMASH Polygalacturonase Juice Industry Pentopan® Mono Xylanase Baking industry Promozyme® D2 Pullulanase Starch industry Saczyme® Glucoamylase Alcohol Industry SAN Extra® Glucoamylase Alcohol industry SAN Super 360L® Glucoamylase / Alpha-amylase / Protease Alcohol industry Shearzyme® Xylanase Starch industry Spirizyme® Glucoamylase Ethanol industry Termamyl® All except Termamyl® Classic Alpha-amylase Starch industry Toruzyme® Transferase Starch industry Viscoferm® Cellulase / Xylanase / Betaglucanase Alcohol Industry Feed Applications: Bio-Feed® Wheat Xylanase Animal feed industry Bio-feed® Phytase Phytase Animal feed industry Other Applications: Alcalase® Subtillisin Detergent industry Aquazym® LT-L Alpha-amylase Textile industry Aquazym® 120 L Alpha-amylase Textile industry Aquazym® 240 L Alpha-amylase Textile industry Aquazym® Ultra Alpha-amylase Textile industry Aquazym Prime® Alpha-amylase Textile industry Aquazym® SP Alpha-amylase Textile industry Aquazym® SD Alpha-amylase Textile industry Aquazym® MT Alpha-amylase Textile industry BioPrep® Pectate lyase Textile industry Carezyme® Cellulase Detergent industry Celluclean® Cellulase Detergent industry Cellusoft® AP L Cellulase Textile industry Cellusoft® CR Cellulase Textile industry Cellusoft® 25000 Cellulase Textile industry Clear-Lens® LIPO Lipase Personal care industry DeniLite® Laccase Textile industry DeniMax® 601 Cellulase Textile Industry DeniMax® 399 Cellulase Textile Industry Duramyl® Alpha-amylase Detergent industry Endolase® Cellulase Detergent industry Everlase® Subtillisin Detergent industry Extruzyme® Pro Alpha-amylase Pet food industry Greasex® Lipase Leather industry Kannase® Subtillisin Detergent industry Lipex® Lipase Detergent industry Lipolase® Lipase Detergent industry Liquanase® Subtilisin Detergent industry Liquozyme® Alpha-amylase Starch and Ethanol industry Mannaway® Mannanase Detergent industry NovoBate® 100 Trypsin Leather Industry NovoBate® 115 Trypsin Leather Industry NovoCor® AX Subtilisin / Alpha-amylase Leather Industry NovoCor® ADL Lipase Leather industry NovoCor® ABG Protease Leather Industry NovoCor® ABL Protease Leather Industry NovoCor® SG Subtilisin Leather Industry NovoCor® SL Subtilisin Leather Industry NovoLime® Subtilisin / Lipase Leather Industry Novoprime® A 328 Cellulase Textile industry Novoprime® A 378 Cellulase Textile industry Novoprime® A 388 Cellulase Textile industry Novoprime® A 868 Cellulase Textile industry Novoprime® A 878 Cellulase Textile industry Novoprime® A 888 Cellulase Textile industry Novoprime® A 966 Cellulase Textile industry Novoprime® B 958 Cellulase Textile industry Novoprime® B 969 Cellulase Textile industry Novoprime® A 979 Cellulase Textile industry Novoprime® Base 268 Laccase Textile industry Novoprime® D 659 Alpha-amylase Textile industry Novo-Pro D® Protease Pet food industry Novozym® 388 Lipase Biocatalysis Novozym® 435 Lipase Biocatalysis Novozym® 476 Cellulase Paper industry Novozym® 525 F Lipase Biocatalysis Novozym® 539 HP F Protease Biocatalysis Novozym® 735 Lipase Textile industry Novozym® 871 Lipase Pet food industry Novozym® 50004 Glucoamylase Alcohol industry Novozym® 51003 Laccase Paper industry Novozym® 51032 Lipase Paper industry Ovozyme® Subtilisin Detergent Polarzyme® Subtilisin Detergent Pyrase® Protease Leather industry Resinase® Lipase Paper industry Savinase® Protease Detergent industry Scourzyme® Pectate lyase Textile industry Stainzyme Alpha-amylase Detergent industry Suberase® Laccase Corks Termamyl® Alpha-amylase Detergent industry Terminox® Ultra Catalase Textile industry Valumax® Cellulase Textile industry ot contain any GMMs.

Pozor - výsledný metabolit může být toxičtější než výchozí! : Bioremediace – čištění životního prostředí: Největší počet současných aplikací a patentů v biotechnologiích! Využití schopnosti některých mikroorganizmů metabolizovat škodliviny za vzniku energie a biomasy: Přesně cílené genetické inženýrství- zabudování genů specifických pro metabolismus dané škodliviny: rychlejší než přirozená adaptace: vyšlechtěny kmeny metabolizující různé polutanty Kmeny bakterií Substrát Pseudomonas atrazin, akrylonitril, xyleny, toluen, styren, nitrobenzen, fenanthren, chlorované uhlovodíky, bifenyl.... Rhodococcus styren, tetrahydrofuran, cyklohexanol... Streptomyces fenanthren, DDT... Agrobacterium glyfosát, atrazin... Helicobacter PCB Pozor - výsledný metabolit může být toxičtější než výchozí! Př.:degradace trichlorethylenu na toxičtější vinylchlorid Databáze univerzity v Minnesotě (katabolismus chemikálií): 900 sloučenin, 600 enzymů, 1000 reakcí, 350 organismů

Fytoremediace čištění životního prostředí činností rostlin: Zejména: akumulace a vázání těžkých kovů, + případně zpětná izolace - „phytomining“. Mechanismus: fytostabilizace: znečišťující látky jsou vázány či jinak imobilizovány v rostlině či jejím bezprostředním okolí; rhizodegradace: vlivem exudátů z rostliny je stimulována rozkladná činnost bakterií v prostoru kořenového systému (rhizosféře); fytohydraulika: hluboko kořenící rostliny (např. topol) mohou vázat nebo rozkládat kontaminanty z podzemních vod; fytoextrakce (fytoakumulace): rostliny svými kořeny přijímají kontaminanty a degradují je nebo shromažďují v nadzemních orgánech; k odstranění z prostředí potom dojde po sklizni rostlin – lze je například spálit a recyklovat kovy; fytovolatilizace: odstranění těkavých látek z vody či půdy transpirací; fytodegradace: biotransformace kontaminantů v orgánech rostliny. http://www.cee.vt.edu/ewr/environmental/teach/gwprimer/phyto/phyto.html

Biotechnologie v medicíně INZULIN: 1982 =nová éra biotechnologie: Do plasmidu bakterie Escherichia coli vložen úsek DNA – sestřižený (- introny) lidský gen kódující lidský inzulin (dříve získáván podobný ze zvířat –imunitní reakce!). V takto transformované bakterii se transkripcí tvoří odpovídající RNA a následně translací žádaný peptid Terapeutické (monoklonální) protilátky vznikají fúzí „nesmrtelných“ myších myelomových (rakovinných) buněk, schopných prakticky neomezeného dělení, a B-lymfocytů, produkujících specifickou protilátku. Splynutím – hybridomy: Neomezeně se množí (in vitro nebo in vivo) a produkují protilátku: Rozpoznání a specifická vazba na protein nebo na povrch buňky použití samostatně (aktivace imunity) nebo jako cílený nosič léku, zářiče… 2004 - Avastin® Genentech

Přehled GM léků firmy Genentech (/Roche), 1985 – Protropin®– pro léčbu dětí s nedostatkem růstového hormonu (do r. 2004) 1987 – Activase® tkáňový aktivátor plasminogenu– rozpouští krevní sraženiny 1990 – Actimmune® (rekombinantní lidský interferon gamma-1b) – pro snížení frekvence závažných infekčních komplikací při chronické granulomatózní chorobě 1993 – Nutropin® (– pro léčbu poruch růstu u dětí a jako náhrada u dospělých 1994 – Pulmozyme® (dornáza alfa, rekombinantní lidská deoxyribonukleáza) – inhalační léčba cystické fibrózy 1997 – Rituxan® (rituximab, monoklonální protilátka) – léčba některých lymfomů 1998 – Herceptin® (trastuzumab, monoklonální protilátka) – pro léčbu některých typů metastazujícího karcinomu prsu 2000 – TNKase® (analog lidského tkáňového aktivátoru plasminogenu) – rozrušení krevních sraženin při akutním infarktu myokardu 2003 – Xolair® (omalizumab, monoklonální protilátka) – pro léčbu alergického astmatu 2003 – Raptiva® (efalizumab, monoklonální protilátka) – pro léčbu psoriázy 2004 – Avastin® (bevacizumab, monoklonální protilátka) – pro léčbu metastazujícího karcinomu tlustého střeva a konečníku 2006 – Lucentis® (ranibizumab, Fab fragment monoklonální protilátky) – pro léčbu neovaskulární formy věkem podmíněné makulární degenerace  

Geneticky modifikované rostliny: 1)Vnesení cizí DNA: pomocí onkogenního (Ti) plasmidu bakterie Agrobacterium tumefaciens (nádory dvouděložných rostlin) Přírodní genový inženýr : umí vnést do chromozomů rostliny část své genetické informace. Ti -plasmid lze změnit tak, že nevyvolává vznik nádorů, ale zachová si schopnost vnášet geny do rostlinných buněk: Upraveným (geneticky modifikovaným) plasmidem se infikují buněčné kultury nebo přímo listy…. Regenerací – celé rostliny (značná část prakticky pěstovaných: kukuřice, sója, řepka, brambor.., GM pšenice – problémy, testy prozatím zastaveny 2) Biolistická metoda „Nastřelování“ nového genetického materiálu přímo do jádra buněk pomocí mikroprojektilů (Au, W) potažených vnášenou DNA ) Používá se např. u bavlníku. Nevýhoda – nepřesné umístění nových genů → menší životaschopnost asi 1 µm

-biolistická transfekce Transformační metody (genetické inženýrství) : elektroporace Particle gun -biolistická transfekce (ca. 1 µm Au, W) http://www.uoguelph.ca/plant/research/

Cíl modifikace rostlin: I Improved product quality (durability, firmness, fruit ripening delayed, processing value) II Pest resistance (insects, nematodes, viruses) III Agronomic benefits (herbicide tolerance, hybrid system)

HT – herbicide-tolerant = Roundup-resistant: 63% GMO rostlin = Roundup-ready sója (také bavlník, řepka, kukuřice) Do rostlin vloženy (obvykle prostřednictvím plasmidů) geny, aby byly překonány účinky glyfosátu (Roundup). Glyfosát (N-fosfonometylglycin) inhibuje aktivitu enzymu EPSPS (5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntázy), který zprostředkovává syntézu aromatických aminokyselin. Nefunkční enzym (obdobný pro bakterie a rostliny) vede ke smrti rostlin. U živočichů se nevyskytuje. GMO: funkce rostlinného EPSPS nahrazena upraveným CP4 EPSPS

Druhy používané jako krmivo, potravina, biopalivo: Nebezpečí: USDA/ Scott Bauer Druhy používané jako krmivo, potravina, biopalivo: Roundup-ready řepka: 4. nejčastější GMO Roundup-ready sója: 41 % půdy v Brazílii EU: od r.2008 povolen dovoz GM sóji jako krmiva a potraviny Rumunsko je jediný producent GM sóji v Evropě: 35 000 hectarů (tajná vrátka GM technologií do Evropy?) Nebezpečí:  Odolnost, i proti vysychání, rychlý růst – vlastnosti typické pro invazní druhy Možnost hybridizace s jinými Brassicaceae plevely! Při masivní aplikaci jednoho herbicidu se u řady rostlin vyvinula odolnost  Na polích bez plevele klesá početnost populací motýlů… Foto USDA Scott Bauer „sebevražedná semínka“ – terminátorová technologie  2010: Pozorován vliv krmiva na plodnost křečků : Vliv herbicidu?

nyní zákaz pěstování GM kukuřice B) Bt modifikace: transgen Bt endotoxin cílená a trvalá ochrana proti zavíječi kukuřičnému -produkcí CrylA(b) proteinu, (přirozeně se vyskytuje v půdní bakterii Bacillus thuringiensis Bt protein je v zažívacím traktu škůdce aktivován v toxin-váže se ke specifickým receptorům střevní výstelky: toxický účinek a zánik buněk – larva zavíječe umírá do 72 hodin. Pro jiné živočichy je Bt protein neškodný, nemají příslušné receptory Ostrinia nubilalis + sekundární infekce plísněmi (Fusarium)→ fumonisiny. 2007 GM kukuřice MON810 /ha Spain 75 000 France 20 000 Germany 2 650 Czech Republic 5 000 Portugal 3 000 Francie a Německo – nyní zákaz pěstování GM kukuřice Námitky: Nikdo podrobně nezkoumal, co se děje s edafonem Existují spící geny a jiné nejasnosti Rostliny jsou polyploidní – GM-neGM se mohou zkřížit

Nagojský protokol: Konec BIOPIRÁTSTVÍ ! je nutno zabránit velkým korporacím v monopolizaci miliardových zisků z genetických zdrojů (a jejich odvozenin) a donutit je sdílet profit s rozvíjejícími se zeměmi. http://www.nwrage.org/category/topics/biopiracy Mnoho výrobků, od drog a léčiv po zubní pasty a make-up má svůj původ v rostlinách z rozvojových zemí, např. z tropických pralesů Latinské Ameriky nebo Jihovýchodní Asie bez vědomí a souhlasu obyvatel. Kam to ale povede?? Andhra Pradesh Biodiversity Board požaduje licenční poplatky od firmy Monsanto India Ltd za genetickou informaci, která byla údajně ukradena z Bt bakterie nalezené v půdě vesnice Mahanandi v kraji Kurnool Problém: USA, nejsou signatářem CBD, mají jen statut pozorovatele největší světový uživatel genetických zdrojů

Jiné modifikace: Vlajková loď GMO – rajče Flavr Savr se už nepěstuje v Evropě ani v Sev. Americe: obsahovalo deaktivovaný gen odpovídající za tvorbu polygalakturonázy, způsobující měknutí plodu Problémy: např. technologie využívající nebezpečných sekvencí promotorů (CaMV)-možné nežádoucí efekty, nedostatečná dokumentace pokusů (myší)…, nevhodná základní odrůda GM rostliny pro zdraví: víc omega-3 PUFA (proti depresím…) BASF : řepka s 5 vloženými geny Genom z řas přirozeně produkujících EPA a DHA • Budoucnost energetiky : biopaliva 3. generace: Craig Venter’s comp.. Syntetická genomika: genetická informace z mikrobů adaptovaných pro extrémní podmínky →nový mikroorganismus schopný přeměnit (zemědělský) odpad na etanol GM energetické plodiny…snížený obsah ligninu a celulózy

deficit způsobuje 500 000 případů dětské slepoty— Vitamin A  deficit způsobuje 500 000 případů dětské slepoty— 2 až 3 milliony úmrtí ročně Až 40 % dětí do 5 let -oslabený imunitní systém (Indie – velká kampaň – suplementace 2x ročně) Zlatá rýže: Golden Rice Humanitarian Board Ingo Potrykus (Švýcarsko), Peter Beyer (Německo) autoři 1. verze zlaté rýže +International Rice Research Institute, the philanthropic Rockefeller Foundation, USAID Cíl: osivo zdarma pro farmáře s příjmem do 10 000 USD/rok 1. generace(1999): gen z narcisu vložen do rýže 2. generace (Syngenta 2004): podobný gen z kukuřice 23 x víc β-karotenu (37 µg / g rýže) Dosud nerealizováno – politické příčiny, Odpor antiglobalizačních aktivistů (testy v oblasti Basmati) Oryza sativa β-karoten (provitamin A) v endospermu transgenních rostlin

Geneticky modifikovaná zvířata: GM řešení: GM kozy: (vložen gen pro lidský antithrombin) Atryn se získává z mléka. Evropa od r. 2006, USA 2009 http://www.wired.com/wiredscience/2009/01/drugsfromgoats/ omega-3 nenasyc. mastné kyseliny (PUFA): V populaci je obecně nedostatek Mělo by se jíst víc ryb – ale hrozí přelovení (i tuňák by měl být VU) GM řešení: GM triploidní (sterilní) losos (Fy. Aqua Bounty) s geny pro růstový hormon a příslušnými promotory z jiných ryb Velký GM losos bude pravděpodobně brzy povolen v USA a Kanadě Salmo salar, Aqu Advantage ™ Roste celý rok Přísné podmínky: vnitrozemské sádky, jen smluvní chovatelé

(různé podmínky pro povolení, Cartagenský protokol o biologické bezpečnosti (GMO): 1999 Cartagena, 2000 Montreal Základní dokument o nakládání s živými modifikovanými organismy - GMO Cíle: Bezpečná přeprava, zacházení a používání živých modifikovaných organismů vzniklých moderními biotechnologiemi které mohou mít negativní vliv na zachování a trvalou udržitelnost biodiverzity Biosafety Clearing –House =Informační systém 3 stupně manipulace: (různé podmínky pro povolení, u nás-MŽP) 1.uzavřený systém 2.uvedení do ekosystému Directive 2001/18/EC 3.uvedení do oběhu Zvláště: lidské zdraví, přeshraniční přeprava Zákon se netýká technik buněčné fúze apod.,odpovídající přirozenému šlechtění Léčiva: specifické hodnocení rizika léčivého přípravku Z rostlin v EU v oběhu (komerčním pěstování) -jen kukuřice, od 2010 brambor) Rumunsko- sója

Legislativa – značení produktů ZÁKON 78/2004 Sb. ze dne 22. ledna 2004 o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty Produkty GM plodin je nutno separovat od ostatních a označovat jejich původ v případě, že postupují dále do výrobního řetězce. K separaci přispívají pravidla koexistence (vzdálenosti polí…). Nakládat s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty lze jen na základě oprávnění (MŽP) podle tohoto zákona. Mezi státy: Nutný informovaný souhlas před povolením importu GMO do země Registr povolených geneticky modifikovaných organismů (dle zákona č. 78/ 2004 Sb.) uvádění do životního prostředí U nás - polní pokusy: Brambor se změněným složením škrobu , Brambor se zvýšenou odolností k Phytophtora Brambor se zvýšeným podílem amylopektinu Brambor se zvýšeným podílem amylózy Hybrid kukuřice NK603 x MON 810 Kukuřice linie GA21 Kukuřice NK603 Len setý Slivoň Stanley Registr uživatelů GMO - souhrn

Registraci podléhají i jednotlivé geny aplikované v GE 14979 cp4 epsps Glyphosate tolerance Agrobacterium tumefaciens strain CP4 The cp4 epsps gene encodes for a version of EPSPS that is highly tolerant to inhibition by glyphosate and therefore leads to increased tolerance to glyphosate-containing herbicides. 14985 cry1A(b) Lepidoptera resistance Bacillus thuringiensis The cry1A(b) gene codes for a Bt-toxin, which protects the plant from the European corn borer (Ostrinia nubilalis). A také organismy používané jako donory, recipienty, vektory Př.. 12082 -Agrobacterium tumefaciens strain CP4 (crown gall http://www.mzp.cz/cz/registr_povolenych_geneticky_modifikovanych_organismu

Značení potravin s obsahem živých GMO („LMO“) je podle zákona č. 153/2000 Sb. povinné již od roku 2001. Na obalu výrobku musí být uvedeno zřetelné označení: “geneticky modifikovaný organizmus”nebo “tento výrobek obsahuje geneticky modifikovaný organizmus” Značení potravin s neživými GMO je podle zákona o potravinách č. 306/2000 Sb. povinné od roku 2002. Na obalu výrobku musí být podle vyhlášky č. 24/2001 Sb. uvedeno označení: “geneticky modifikováno”nebo “obsahuje geneticky modifikovaný organizmus” “vyrobeno z geneticky modifikované…..” (nebo označí * v seznamu složek a uvede se stejný výraz pod tímto seznamem) Není povoleno logo!

Regulation (EC) 1829/2003 on genetically modified food and feed + Regulation (EC) No. 641/2004 on detailed rules: Stále platí princip předběžné opatrnosti, ale pravidla byla přizpůsobena realitě Zákon 78/2004: Výrobek musí mít tato označení obsahuje-li více než 0,9 % geneticky upravených přísad. Všechny povolené GMO v evropských potravinách jsou uvedeny v registru Evropské komise (Community Register of GM Food and Feed) Příklady: Emulgátory nebo zahušťovadla (v pudincích, krémech..)získaná z GM sóji nebo GM kukuřice – v tomto případě je označení nutné. Živé kvasnice a bakteriální kultury. Ale produkty obsahující jen enzym nemusejí být označeny! Novinky v legislativě (2010): rozhodnutí o povolení či zákazu pěstování GMO bude spočívat na úrovni členských států. Platí ale pouze pro GM plodiny autorizované na úrovni EU. Členský stát tedy nemá možnost povolit pěstování GM plodiny, která není autorizována v rámci EU. EU: označit od 0,9% obsahu GMO v ne-GMO!

Značení a rozlišení GMO-nonGMO: Reportérové a markerové geny: Snadno měřitelné vlastnosti – veličiny: Např. nedestruktivně fluorescence rostlin Vložený gen- green fluorescent protein GFP z medúzy Aequorea victoria. (fluorimetr s optickým vláknem) 2) Metody typu ELISA..produkované enzymy 3) Identifikace genů – Polymerase chain reaction PCR -syntetické úseky DNA (primery) použity k detekci GM sekvencí http://nobelprize.org/educational_games/chemistry/pcr/ Detekují se charakteristické sekvence, obvykle používané u genových manipulací Analýza namnožených fragmentů: DHPLC (denaturační HPLC), gelová elektroforéza Poředí nukleových kyselin - sekvenace

Potenciální nebezpečí GMO – protesty environmentalistů: (Greenpeace – útvar pro vyšetřování GM zločinů, Mothers for Natural Law…) Hlavní námitky – monopol firmy MONSANTO : (91 % všech GMO semen) 60% světové produkce sóji (Glycine max) 14% kukuřice (Zea mays) 28% bavlny (Gossypium hirsutum) 18% řepky (Brassica napus) Marketingové strategie: Terminátorová technologie: sterilní semena – problém pro rozvojové země Patentová ochrana : soudy v případě opakovaného výskytu: krádež nebo přenos?? Monsanto dodává i herbicidy Nedestruktivní měření fluorescence (fluorimeter s optickými vlákny)

BIOZEMĚDĚLSTVÍ Biopotravina, bioprodukt má osvědčení podle pravidel Rady (EHS) č. 2092/91 a zákona č. 242/2000 Sb., o ekologickém zemědělství Logo českých biopotravin : biozebra +identifikační kód kontrolního orgánu (CZ-KEZ) ČR -biozebra Nabídka: zelenina, obiloviny, ovoce, luskoviny, olejniny, syrové mléko, vejce, maso, víno, ... i biošunka či biouherák (nabídka 2500 výrobků Zatím jen 1% potravin! Starší evropské označení Požadavky: 1x ročně inspekce aspoň 95% výrobku pochází z bioprodukce Produkt dodán zapečetěný přímo od výrobce Výrobek nese jméno výrobce a zpracovatele a kód kontrolního orgánu…. Nové značení v EU - povinné od r. 2010

Program rozvoje venkova (PRV, 2007 - 2013). Dotace: zelenina a speciální byliny: 15 524 Kč/ha

Definice, zákony, pravidla 242/2000 Sb Definice, zákony, pravidla 242/2000 Sb. o ekologickém zemědělství + změna 553/2005 Sb a úplné znění: Zákon č. 30/2006 Sb. O ekologickém zemědělství Ekologický podnikatel nesmí souběžně s produkcí bioproduktů produkovat stejné suroviny rostlinného nebo živočišného původu jinou zemědělskou výrobou. Na ekofarmě je souběžná produkce zakázána. přechodné období… omezení vlivu sousedních pozemků- větrolamy, živé ploty… osvědčení cca. na 1 rok (12-15 měsíců) označení – kód, grafický znak Dle EU se nesmí: používat nepovolená krmiva, hnojiva, dezinfekční prostředky… používat vazné ustájení zvířat používat geneticky modifikované organismy nebo produkty -s výjimkou veterinárních léčiv používat v chovu zvířat látky určené ke stimulaci růstu, užitkovosti nebo hormony

Pokud možno používat biologické a mechanické postupy bez použití GMO EU 2007: nová pravidla: Udržitelné kultivační systémy Ochrana životního prostředí a biodiverzity Vysoký standard ochrany zvířat Pokud možno používat biologické a mechanické postupy bez použití GMO Nepoužívat syntetické růstové hormony Krávy nemají být stále uvázány a mají mít možnost volné pastvy Podíl ekologicky obdělávané plochy Smí se ale: používat i hnojiva a pesticidy ze speciálního seznamu – hlavně anorganické Ustájení a možnost pohybu je stanovena podle druhu a vývojového stupně zvířat.

Podpora ekozemědělství: např. portál http://www.najdisisvehofarmare.cz/:

Biozemědělství = podpora přirozených procesů a zákonitostí: Dobré využití živin, vzájemná „pomoc“ sousedních porostů…… foto Jean-Claude Douet Biozemědělství bez administrativy: Pro rodinu a sousedy

bioindikátory houbových chorob Nelze-li se vyhnout postřikům (povoleným), je dobré je omezit bioindikátory houbových chorob – růže u vinic… Povolené chemické prostředky v biozemědělství: fosforečnan železitý k hubení měkkýšů, měďnaté přípravky jako fungicidy (v množství až 6 kg /ha/ rok) bauxitové postřiky proti plísním a strupovitosti, etylén k inhibici klíčení brambor a cibule, síra jako fungicid, akaricid a repelent, a některé další.

Registrována řada biologických přípravků- mikro i makroorganismů) Legislativa pro biologickou ochranu rostin = registrační hodnocení bioagens nejen v ČR omezení možných rizik pro zdraví lidí, zvířat a pro životní prostředí, zajištění standardnosti a nezávadnosti Schvalovací proces biologických přípravků na bázi mikroorganismů vychází ze Směrnice Rady 91/414/EHS- obdobně jako u chemických přípravků na ochranu rostlin. V ČR má platnou registraci 8 biologických mikrobiálních přípravků (5 organismů) Bacillus thuringiensis (housenky, obaleči, larvy komárů), Bacilovirus diprionis, Coniothyrium minitans, Bacillus subtilis (plísně, houbové choroby kořenů), Trichoderma harzianum-konidie (houbové choroby,padání klíčních rostlin) Bioagens na bázi makroorganismů: uvádění na trh je možné až po zapsání do úředního registru Výjimka-autochtonní druhy: čestné prohlášení Alochtonní druhy pro oblast ČR- přísnější pravidla EPPO, popř. OECD, posuzuje se potenciální možnost rozšíření, autekologické charakteristiky. vlivy na domácí druhy. Registrována řada biologických přípravků- mikro i makroorganismů)

BIOZAHRADA (+ filosofie = permakultura) Zásady: vhodná volba rostlin (podle optima tolerance) Vhodná volba sousedících druhů smíšené kultury: ano ne hrách okurky brambory celer jahody česnek salát petržel karotka cibule fazole Biologické ochranné prostředky: koliny, fytoncidy,pyrethroidy,aromatické látky.. Výsadby, zálivky, postřiky a jíchy z rostlin : Tagetes (afrikán), Tropaeolum (lichořeřišnice), Tanacetum (vratič), Euphorbia (pryšec), Artemisia (pelyněk)… Dobří spolubojovníci: Typhlodromus pyri Dravý roztoč proti škodlivým roztočům (sviluškám…) ve vinicích a sadech Fa.Biocont lumci proti housenkám, mšicím škvoři, slunéčka mšicím draví roztoči sviluškám ropuchy, slepýši plžům

Prostředky přirozené ochrany rostlin: Mšice – vlnatka krvavá: lichořeřišnice Hlodavci- řebčík královský (Fritillaria imperialis) pryšec skočcový (Euphorbia lathyris) Houbové choroby- Preventivní postřiky odvarem z přesličky Padlí- Zedearach (Azadirachra indica) křídlatka (Reynoutria sachalinensis) sójový lecithin Pochmurnatka mrkvová, mol česnekový – sítě Mandelinka bramborová, housenky bělásků, štítenky – včasný sběr Plevel– mechanické odstranění -ale ne totální Plži – plechové zábrany, pivní pasti, kachny, ježci, ještěrky, rejsci, krtci, ropuchy. Nemaslug http://www.biocont.cz/ Parazitické hlístice Phasmarhabditis hermaphrodita + symbiotické bakterie proti slimákům http://www.sluginvaders.co.uk/

Nařízení (EC) 1829/2003 o geneticky modifikovaných potravinách a krmivech+ Nařízení (EC) 641/2004) o podrobných pravidlech..: Stále platí princip předběžné opatrnosti, ale pravidla byla přizpůsobena realitě Zákon 78/2004: Výrobek musí mít tato označení obsahuje-li více než 0,9 % geneticky upravených přísad. Všechny povolené GMO v evropských potravinách jsou uvedeny v registru Evropské komise (Community Register of GM Food and Feed) Příklady: Emulgátory nebo zahušťovadla (v pudincích, krémech..)získaná z GM sóji nebo GM kukuřice – v tomto případě je označení nutné. Živé kvasnice a bakteriální kultury. Ale produkty obsahující jen enzym nemusejí být označeny! Obchodní politika – označování výrobků bez GMO EU: označit od 0,9% obsahu GMO v ne-GMO! Novinky v legislativě (2010): rozhodnutí o povolení či zákazu pěstování GMO bude spočívat na úrovni členských států. Platí ale pouze pro GM plodiny autorizované na úrovni EU. Členský stát tedy nemá možnost povolit pěstování GM plodiny, která není autorizována v rámci EU.

BIOZEMĚDĚLSTVÍ Biopotravina, bioprodukt má osvědčení podle pravidel Rady (EHS) č. 2092/91 a zákona č. 242/2000 Sb., o ekologickém zemědělství Logo českých biopotravin : biozebra +identifikační kód kontrolního orgánu (CZ-KEZ) ČR -biozebra Nabídka: zelenina, obiloviny, ovoce, luskoviny, olejniny, syrové mléko, vejce, maso, víno, ... i biošunka či biouherák (nabídka 2500 výrobků Zatím jen 1% potravin! Starší evropské označení Požadavky: 1x ročně inspekce aspoň 95% výrobku pochází z bioprodukce Produkt dodán zapečetěný přímo od výrobce Výrobek nese jméno výrobce a zpracovatele a kód kontrolního orgánu…. Nové značení v EU - povinné od r. 2010