Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Expresní systémy živé systémy využívající rekombinantních DNA technologií pro produkci bioorganických látek (především proteinů)

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Expresní systémy živé systémy využívající rekombinantních DNA technologií pro produkci bioorganických látek (především proteinů)"— Transkript prezentace:

1 Expresní systémy živé systémy využívající rekombinantních DNA technologií pro produkci bioorganických látek (především proteinů)

2 BakteriálníBakteriální KvasinkovéKvasinkové Hmyzí buňkyHmyzí buňky Savčí buňkySavčí buňky Transgenní rostlinyTransgenní rostliny Heterologní expresní systémy

3 charakteristikaE. colikvasinkyhmyzí buňkysavčí buňky buněčný růstrapidní (30min)rapidní (90min)pomalý (18-24h)pomalý (24 h) požadavky na růstové medium minimální komplexní medium cena růstového medianízká vysoká množství exprimovaného proteinu velkémalé až velké malé nebo střední extracelulární exprese sekrece do inkluzních tělísek sekrece do media posttranslační modifikace skládání proteinů obvykle nutné dodatečné složení v některých případech nutné dodatečné složení řádně složené proteiny N-glykosylace- vysoký obsah manosy jednoduché, bez sialové kyseliny komplexní O-glykosylace-+++ fosforylace-+++ acetylace-+++ acylace-+++ γ-karboxylace---+

4 + rychlá produkce + nejvýkonnější (až 0.5 g na 1 litr kultury) + levné a jednoduché na manipulaci - chybí posttranslační úprava proteinů (neaktivní produkty eukaryotních genů) (neaktivní produkty eukaryotních genů) - přirozeně neprobíhá sekrece do média - preferují jiný genetický kód než vyšší eukaryota Bakteriální expresní systémy Escherichia coli

5 rekombinatní genetická informace je vklonována do vhodného expresního plasmidu, nedochází k integraci do genomu TA klonování TA TOPO klonování

6 rekombinační klonování místně specifický rekombinatní systém bakteriofága lambda – att attB x attP ↔ attL x attR (“x” znamená rekombinaci). vzájemná rekombinace mezi nimi probíhá podle daných pravidel obě rekombinace jsou katalyzovány proteiny kódované jak αDNA tak bakteriální. selekce antibiotikum a gen ccdB mezi rekombinantními místy, protein ccdB inhibuje bakteriální DNA gyrasu a způsobuje smrt buněk nesoucí prázdný vektor

7 LR reakce BP reakce LR reakce BP reakce se účastní integrasa a ekscionasa (αDNA) se účastní IHF a integrasa a IHF (integration host factor) z bakterie a IHF (integration host factor) z bakterie rekombinační klonování

8 Invitrogen dodává všechny typy vektorů kompatibilních pro rekombinantní klonování Reakce trvá 1 hodinu při laboratorní teplotě zachovávání čtecích rámců (ORF), žádné složité plánování

9 T7 promoter T7 promoter přesná exprese heterogenního proteinu Ribosome binding site TOPO klonovací místo pro PCR produkt Xpress™ epitop Xpress™ epitop (Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp- Lys) umožňuje detekci fúzního proteinu pomocí Anti-Xpress™ protilátky N-terminal 6xHis tag umožňuje velice účinnou purifikaci proteinu pomocí metal-chelatační chromatografie popř. detekci pomocí Anti-HisG protilátkyEK rozpoznávací sekvence pro specifickou enterokinasu, odštěpuje His-tag T7 transcription termination region T7 transcription termination region silný terminační systém T7 bacteriofága gen pro rezistenci k ampicilinu umožňuje selekci plasmidu v E. coli pUC origin pUC origin zajišťuje vysokou replikaci plasmidu a růst E. coli C-terminal V5 epitope tag umožňuje detekci fúzního proteinu pomocí Anti-V5 protilátky

10 his tagx-pressexprimovaný proteinsignální peptid izolace  detekce „“„“„“„“ forward primer reverse primerTAG his tagV5 epitopexprimovaný proteinsignální peptid izolacedetekce „“„“„“„“ ATGforward primer reverse primerTAG exprimovaný protein

11 usnadnění izolace rekombinantního proteinu koncové značky nejpoužívanější N a C-terminální značky (tagy):  His-tag pro metal chelatační chromatografii (Ni)  FLAG epitope - tag DYKDDDDK (Sigma; specifická protilátka ) (Sigma; specifická protilátka )  CBP - calmodulin binding peptide (26 AK) (26 AK)  CBD - cellulose binding domain

12 TRANSFORMACE baktérii a kvasinek přímý přenos genetické informace z okolí do organismu KOMPETENTNÍbuňka schopná přijmout DNA (plasmid) se nazývá KOMPETENTNÍ přirozeně kompetentní jsou některé kmeny Bacillus subtilis, Hemorheae influenze atd. všechny ostatní se mohou transformovat po uvedení do kompetentního stavu dvěma způsoby: A) ELEKTROPORACE B) CHEMICKÁ METODAA) ELEKTROPORACE B) CHEMICKÁ METODA buňky se pořádně promyjí diH 2 O smíchají s plasmidovou DNA rozpuštěnou elektroporátoru také v diH 2 O a vloží do elektroporátoru buňky se ošetří roztokem rubidné a vápenaté soli, které způsobují větší permeabilitu membrány DNA se smísí s těmito buňkami a provede se tzv. HEAT SHOCK (45 sec. 42°C)    EFEKTIVITA     NÁROČNOST 

13 Který kmen E.coli zvolit? tonA tonA mutace chrání bakterii před napadením T1 a T5 fágem, chrání tak vaše klony lacZ.M15 lacZ.M15 částečná delece wild-typového lacZ genu, po vložení plasmidu dochází k tzv.α- komplementaci potřebné pro blue/white screening na miskách s X-gal endA1 endA1 deficience endonukleasy I zaručuje kvalitní izolaci plasmidové DNA lacIq lacIq produkuje lacZ represor negativně regulující transkripci z lacZ promotoru; zrušení přídavkem IPTG mcrA, mcrBC, a mrr mcrA, mcrBC, a mrr mutace v těchto genech zaručuje možnost klonování i methylované genomové DNA recA1 recA1 zabraňuje rekombinaci mezi plasmidovou a bakteriální DNA F´ episom F´ episom je potřebný pro produkci ssDNA kóduje protein tvořící tzv pilus na vnější membráně E.coli

14 regulace exprese pod T7 promotorem exprese naklonovaného genu je kontrolována velice silným promotorem z bakteriofága T7, který původně řídí expresi genu 10 pro obalový proteinexprese naklonovaného genu je kontrolována velice silným promotorem z bakteriofága T7, který původně řídí expresi genu 10 pro obalový protein pro expresi je nutno dodat do hostitelským buněk T7 RNA polymerasu a to buď infekcí bakteriofágem, nebo její indukovanou expresi.pro expresi je nutno dodat do hostitelským buněk T7 RNA polymerasu a to buď infekcí bakteriofágem, nebo její indukovanou expresi. v sytému pCR ® T7 TOPO® TA Expression je exprese T7 RNA polymerasy indukována lacZ promotorem pomocí IPTG a tento systém je uložen v genomu hostitelských buněkv sytému pCR ® T7 TOPO® TA Expression je exprese T7 RNA polymerasy indukována lacZ promotorem pomocí IPTG a tento systém je uložen v genomu hostitelských buněk

15 kmeny E.coli vhodné pro expresiBL21(DE3) nebo BL21(DE3)LysS kmeny E.coli vhodné pro expresi - BL21(DE3) nebo BL21(DE3)LysS

16 před indukci IPTG probíhá bazální exprese T7 RNA polymerasy, pokud je exprimovaný produkt toxický pro bakterii, nedojde k selekci, selektují se pouze mutované klony, které neprodukují rekombinantní protein BL21(DE3)kmen E.coli BL21(DE3) nese v genomu T7 RNA polymerasový gen pod lacZ promotorem, tento konstrukt je vložen do genu pro integrasu, jehož inaktivaci se zabrání lyzi, vyštěpení fágové částice v nepřítomnosti pomocného fága. Přirozený lac represor, jehož gen je taktéž vložený genomu bakterie, brání expresi bez přítomnosti induktoru (IPTG) BL21(DE3)LysSněkdy ovšem i přesto dochází k bazální expresi T7 RNA polymerasy a pokud je pod T7 promoter vložen gen produkující toxický produkt pro E.coli může docházet k redukci růstu, smrti baktérie či nestabilitě plasmidu. Kmen BL21(DE3)LysS navíc obsahuje T7 lysozym (produkovaný genem LysS), uložený na speciálním vektoru s nízkou expresí a nezávislou selekci na chloramfenikol. T7 lysozym je schopen se vázat na T7 RNA polymerasu a inhibovat bazální transkripci, exprese indukovaná IPTG je daleko silnější a T7 RNA polymerasa se dostane z této inhibice T7 lysozym je bifunkční enzym, který má navíc vlastní lytickou funkci, naštěpuje bakteriální peptidoglykanovou stěnu a usnadňuje tak následnou izolaci exprimovaného proteinu.

17 Jaké geny lze v E.coli exprimovat? většinu z prokaryotických organismůvětšinu z prokaryotických organismů eukaryotní geny jejichž produkty nepodléhají posttranslačním modifikacímeukaryotní geny jejichž produkty nepodléhají posttranslačním modifikacím většina cytosolárních proteinů (není glykosylovaná)většina cytosolárních proteinů (není glykosylovaná) geny kódované chloroplastovou nebo mitochondriální DNAgeny kódované chloroplastovou nebo mitochondriální DNA (podobný genetický kód, evoluční příbuznost) (podobný genetický kód, evoluční příbuznost) všechny geny jejichž produkty nepotřebujeme v aktivní forměvšechny geny jejichž produkty nepotřebujeme v aktivní formě

18 E. coli Arabidopsis th. H. sapiens AGA 2.2% AGA 18.9% AGA 11.9% AGG 1.6% AGG 11.0% AGG 12.1% kodón pro arginin (6 různých): CGUAGA CGAAGG CGGCGC odchylky v genetickém kódu? snižují výtěžek heterologní exprese výjimky: jiná preference:

19 mutace místně cílená (site-directed mutagenesis) mutace místně cílená (site-directed mutagenesis) gen, či sekvenci kterou budeme chtít mutovat, je třeba naklonovat do vhodného vektorugen, či sekvenci kterou budeme chtít mutovat, je třeba naklonovat do vhodného vektoru navržení dvou komplementárních primerů, v místě kde chceme mutovat, nesoucí tuto mutacinavržení dvou komplementárních primerů, v místě kde chceme mutovat, nesoucí tuto mutaci M G A L L W L původní sekvence 5’ ATG GGA GCT CTA TTA ACC TTA 3’ forward primer 3’ TAC CCT CGA GAT AAT TCG AAT 5’ reverse primer 5’ ATG GGA GCT CTA TTA AGC TTA 3’ M G A L L S L PCR s těmito primery na templátový plasmid a s Pfu polymerasou (se samoopravnou funkcí)PCR s těmito primery na templátový plasmid a s Pfu polymerasou (se samoopravnou funkcí) vytváří se nové cirkulární DNA nesoucí mutaci, jsou k sobě komplementární a drží u sebe, mají přerušení v místě konce primerů (tzv. nick)vytváří se nové cirkulární DNA nesoucí mutaci, jsou k sobě komplementární a drží u sebe, mají přerušení v místě konce primerů (tzv. nick) ošetření restrikční endonukleasou DpnI (štěpí pouze methylovanou DNA, tedy templátový plasmid)ošetření restrikční endonukleasou DpnI (štěpí pouze methylovanou DNA, tedy templátový plasmid) transformace do bakterie a namnožení mutovaného plasmidutransformace do bakterie a namnožení mutovaného plasmidu Stratagene 

20 stabilizace exprimovaného proteinu Sumo proteasa SUMO peptide – Small Ubiquitin like MOdifier ochrana před proteolýzou zvyšování rozpustnosti proteinu zvyšuje množství exprimovaného proteinu 2004

21 testování exprese - optimalizace po transformaci expresního plasmidu do vhodných buněk se namnoží prvotní kultura, selektuje se na vhodném antibiotiku (1.den)po transformaci expresního plasmidu do vhodných buněk se namnoží prvotní kultura, selektuje se na vhodném antibiotiku (1.den) prvotní kultura se pak vhodně naředí čistým médiem na OD – 0.5 (2.den)prvotní kultura se pak vhodně naředí čistým médiem na OD – 0.5 (2.den) indukuje se exprese přídavekem IPTG ( mM) do kultury (2.den)indukuje se exprese přídavekem IPTG ( mM) do kultury (2.den) kultura se inkubuje na třepačce (aerace) při 18-37°C (2.-5. den) a odebírají se vzorky ve kterých se detekuje exprimovaný protein.kultura se inkubuje na třepačce (aerace) při 18-37°C (2.-5. den) a odebírají se vzorky ve kterých se detekuje exprimovaný protein. teplota: 25-18°C 25-18°C – pomalý růst, pomalá exprese, protein je vylučován do cytosolu 37°C 37°C - intenzivní růst, mohutná exprese, pokud je ale protein toxický pro bakterii (většina) je ukládán do tzv. INCLUSION BODIES mikrotělíska zůstávající v bakteriální cytoplasmě – ztížená izolace!!! E.coli nikdy nesekretuje protein do média!

22 izolace proteinu z bakteriální kultury: marker wash I wash II IB bakt.extrakt 1M 100mM200mM 0.5mM imidazol pokud je protein ukládán do inkluzních tělisek, rozbití buněk tepelným šokem, případně sonifikací nebo lysozymem pokud je ukládán do inkluzních tělísek, oddělení nerozpustné frakce a denaturace 9M močovinou nebo guanidium chloridem SLOŽITÉ!!!! poté je nutno protein renaturovat - SLOŽITÉ!!!!

23 exprese proteinů ve velkém měřítku: FERMENTORY regulace: teplotateplota pHpH obsah kyslíkuobsah kyslíku (případně jiných plynů) (případně jiných plynů) přesné dávkovánípřesné dávkování

24 problémy a nedostatky exprese v E.coli problémpříčinařešení buňky umírají, nedaří se selekce toxický produkt, vysoká bazální exprese slabší promotor, kontrola bazální exprese, snížení teploty kultivace nerozpustný produkt (ukládá se do inkluzních tělísek) redukce disulfidických můstků v redukčním prostředí cytoplasmy transport do periplasmy snížení teploty snížení exprese fúze s hydrofilní značkou neaktivní proteinredukce v cytoplasmě afinitní značka ovlivňuje aktivitu změna typu a polohy značky zvýšení osmotického tlaku média (1M sorbitol) žádný proteinpreference jiného genetického kódu dodání raritních tRNA silnější promotor zvýšení počtu kopií plasmidů

25 Bacillus subtilis alternativní prokaryotické expresní systémy gram pozitivní půdní bakteriegram pozitivní půdní bakterie není lidský patogennení lidský patogen má vyvinutý sekreční systémmá vyvinutý sekreční systém neprodukuje žádné endotoxinyneprodukuje žádné endotoxiny (rek. proteiny se dají využít v medicíně) (rek. proteiny se dají využít v medicíně)

26 Bacillus subtilis alternativní prokaryotické expresní systémy laboratorní a průmyslově využívané kmeny B.subtilis mají tyto mutace: delece genu produkujícího tenzidy (sfrC)delece genu produkujícího tenzidy (sfrC) delece genu produkujícího červený pigmentdelece genu produkujícího červený pigment delece genu pro exogenní proteasydelece genu pro exogenní proteasy

27 Bacillus subtilis alternativní prokaryotické expresní systémy Bacillus subtilis je přirozeně kompetentní (má systém přenášející DNA přes buněčnou membránu do buňky)

28 integrace do genomu pomocí homologní rekombinace amyE gen kóduje neesenciální alfa-amylasu

29 Bacillus subtilis alternativní prokaryotické expresní systémy využití pro průmyslovou produkci proteas (prací prášky) a amylas (sladovnictví) a hlavně průmyslově nejdůležitější zdroj kyseliny hyaluronové (polysacharid)

30 operon genů pro syntézu hyaluronové kyseliny z rodu Streptococcus vklonován do genomu Bacillus

31 silný sekreční mechanismus, žádné kontaminující proteiny Streptomyces lividans - půdní bakterie Caulobacter crescentus - vodní baktérie Staphylococcus carnosus - nepatogenní produkce proteinů se zabudovanými radioisotopy 13 C, 15 N a deuteriem Anabaena sp. - sinice silný sekreční mechanismus, žádné kontaminující proteiny Streptomyces lividans - půdní bakterie Caulobacter crescentus - vodní baktérie Staphylococcus carnosus - nepatogenní produkce proteinů se zabudovanými radioisotopy 13 C, 15 N a deuteriem Anabaena sp. - sinice

32 využití rekombinantních bakterií v potravinářství Biotech chymosin Source: Rent Mother Nature  enzym používaný pro srážení mléka v sýr  kvasinkový gen transformovaný do bakterie  biotechnologie nahrazuje chymosin izolovaný z poražených telat  hormon zvyšující u krav produkci mléka  gen z genomu krávy naklonován do baktérie  přidává se do krmiva v kravínech  dříve se používal hormon pracně izolovaný z hypofýzy poražených krav bST (bovine somatotropin)

33 využití rekombinantních bakterií v potravinářství

34 využití rekombinantních bakterií ve farmacii 2002 – 250 miliónů lidí využívalo léčiv a vakcín produkovaných mikroorganismy lidský inzulín (Humulin ® )  inzulín – polypeptid (51 ak)  inzulín pro léčbu diabetiků byl extrahován z pankreasu prasat a krav  prasečí inzulín se liší pouze dvěmi ak  někteří diabetici však produkovali protilátky proti živočišnému insulinu  lidský inzulín se začal syntetizovat uměle (drahé)  1982 poprvé připraven pomocí rDNA technologie  od devadesátých let se produkuje ve velkém a levně lidský insulin pomocí transgenních E.coli nebo kvasinek (např. Humulin ® )

35 využití rekombinantních bakterií ve farmacii lidský růstový hormon (HGH)  produkovaný hypofýzou je důležitý regulátor vývoje člověka  děti s vrozenou deficienci genu pro HGH trpí dwarfismem (zakrslostí)  pravidelné injekce toho hormonu mohou obnovit normální růst  živočišný GH je pro léčbu značně neúčinný  HGH se také izoloval z hypofýz lidských mrtvol  byl zaznamenán zvýšeny výskyt Creutzfeldt-Jakobsovy choroby (kopurifikace prionu)  velice drahé a velká spotřeba mrtvol (např. na izolaci 5 mg hormonu je třeba půl milionů jehněčích mozku)  od devadesátých let produkován pomocí rekombinantních bakterií  litr bakteriální kultury vyprodukuje 5 mg GH za 15 hodin

36 exprese v rostlinách rostlinné buněčné linie se pro produkci látek nepoužívají BY-2 tobacco cells odvozené z dřeně Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow-2 v Japonsku (1974) rychle rostou (12 hod.), netvoří kalusy snadno absorbují různé sloučeniny – studium metabolismu snadná synchronizace – studium buněčného cyklu snadná transformace Agrobacteriem

37

38 Hellwig S. et al. Plant cell cultures for the production of recombinant proteins. Nature Biotechnology 22(11), 2004, TAXOL

39 molekulární farmářství rostlinné – jedlé vakcíny  jako transgeny se používají oslabené toxiny původců mnohých chorob  stimulace mukózního imunitního systému v epitelu trávícího traktu (účinná imunizace)  velice levné a efektivní  značné uplatnění v rozvojových zemích, pojídáním čerstvých plodů se získá imunita vůči nemocem, které v těchto zemích způsobují milióny úmrtí.  vše ve formě testů v rostlinách tabáku a bramboru – zatím úspěšné zubní kaz – protein spaA ze Streptococcus mutans hepatitida B – povrchový antigen HBsAg viru cholera – termolabilní enterotoxin B z Vibrio cholerae 1 g brambor vyrobí 30µg tohoto toxinu brambory se uvaří a toxin denaturuje testy na myši prokázaly vysokou účinnost a neškodnost hlavní snaha vědců je produkce těchto vakcín v plodinách rozšířených ve třetím světě jako je banánovník 1997 poprvé testováno na člověku

40  v rostlinách lze produkovat i monoklonální protilátky  protilátky jsou vylučovány do mezibuněčného prostoru  mohou sloužit přímo v rostlině (jako ochrana proti patogenům)  nebo mohou být extrahovány a použity v diagnostice či medicíně  výrazně se sníží náklady a čas na tvorbu protilátek (hybridomové buňky) molekulární farmářství plantibodies v rostlinách připravené živočišné protilátky nebo části protilátek

41 hlavní problém – rozdíly v N-glykosylaci proteinů (protilátek) u živočichů a rostlinhlavní problém – rozdíly v N-glykosylaci proteinů (protilátek) u živočichů a rostlin plantibodies mají jinak glykosylovanou strukturu a po aplikaci do zvířete vyvolávají nechtěnou imunitní odpověďplantibodies mají jinak glykosylovanou strukturu a po aplikaci do zvířete vyvolávají nechtěnou imunitní odpověď řešení: společně s geny pro Ab je do rostliny vnesen gen pro lidskou β-1,4- galaktosyltransferasu – rostlina pak produkovala „polidštěné protilátky“řešení: společně s geny pro Ab je do rostliny vnesen gen pro lidskou β-1,4- galaktosyltransferasu – rostlina pak produkovala „polidštěné protilátky“ jako transgen stačí vložit pouze malou variabilní oblast tzv. Fv domény z lehkého a těžkého řetězce spojenou krátkým peptidemjako transgen stačí vložit pouze malou variabilní oblast tzv. Fv domény z lehkého a těžkého řetězce spojenou krátkým peptidem molekulární farmářství plantibodies scFv – single chain variable fragment

42  non-hodgkinský lymfom – rakovina lymfatických uzlin (B-lymfocytů)  nádorové buňky produkují specifické protilátky (zachycené na svém povrchu, liší se od zdravých)  tabák infikován TMV s vloženou části genu pro scFV myši  tabák produkuje scFv nádorových buněk

43  tabák produkuje funkční antigen, který po aplikaci myši produkuje protilátky proti nádorovým buňkám  imunitní odpověď nevznikla na mezidruhovou odlišnost „ produkt rostliny – odlišná glykosylace, špatně ustřižený signální peptid  80% myší přežilo  antigen vytvořen během 6 týdnů  velice jednoduchá izolace – RYCHLE A LEVNĚ  léčba (vakcína) dělaná pacientovi přímo na míru

44 antigenrostlina typ rekomb. Protilátky aplikace povrchový antigen Streptokoka tabák sekreční IgA CaroRx™terapeutická povrchová aplikace Herpes simplex virus sója, rýže IgGterapeutická povrchová aplikace spermakukuřiceIgG antikoncepce ve formě gelu non-Hodginský lymfom tabákscFv personalizovaná vakcína virus vztekliny tabákIgGterapeutickáintravenosně CEA - cancer embryonic antigen tabák, rýže, pšenice, rajče scFv, diabodies, chimerické protilátky terapeutickádiagnostická v současné době klinicky testované plantibodies Stoger et al., Recent progress in plantibody technology, Curr. Pharm Design 11, 2005

45  některé bakterie jsou schopny uchovávat uhlík a energii ve formě osmoticky inertních polymerů (polyester k. hydroxymaselné PHB)  tyto jsou pak v přírodě rychle degradovatelné  tři geny z baktérií byly vloženy do rostlin Arabidopsis 3-ketotiolasa NADH-dep. acetoacetyl-CoA-reduktasa PHB-polymerasa  syntéza PHB navazuje na syntézu mastných kyselin, jejíž část probíhá v chloroplastech  pokud byly tyto geny vloženy do jaderného genomu pod 35S promotorem docházelo k nadměrné produkci polyhydroxybutyrátu v listech (PHB tvořil 0.14% sušiny)  pokud byly produkty transgenů cíleny pomocí signálních peptidů do chloroplastů zvýšila se produkce až 100x molekulární farmářství biodegradovatelné plasty

46

47 Arabidopsis slouží jako modelová rostlina předpokládá se že, tento model bude přenesen do nějaké rostliny, která produkuje velké hlízy nebo semena a není konzumována ani člověkem ani zvířaty (skočec Ricinus communis) transgenní řepka vyprodukuje až 10 g PHB na rostlinu fa MONSANTO zatím tento projekt pozastavila, jelikož to stále ještě není ekonomicky výhodné (výroba plastů z fosilních zdrojů je daleko levnější) molekulární farmářství biodegradovatelné plasty

48 další využívané transgeny bezkofeinová káva 7-metylxantin N-metyltransferasa a theobromin N-metyltransferasa JAPONSKO 2003 exprese genů inhibována metodou RNAi druh Cofea canephora transformován Agrobaktériem transformované rostliny stejné jako wild type Cofea canephora se pěstuje na Madagaskaru a má 2x větší obsah kofeinu než nejrozšířenější Cofea arabica v mladých listech:  theobromin 30-80%  kofein 50-70%

49 YEAST TWO HYBRID SYSTEM PRO STUDIUM PROTEIN-PROTEIN INTERAKCÍ – význam pro studium regulačních a signálních drahnaklonovanácDNAknihovna z libovolného euk.organismu konstitutivnípromotor kvasinkovýchromozom HYBRIDNÍ EXPRESNÍ KNIHOVNY HYBRIDNÍ EXPRESNÍ KNIHOVNY systém pro studium interakce protein - protein, bait vektor (návnada) obsahuje gen pro protein, který studujeme a fish (prey) vektor (obsahuje danou cDNA expresní knihovnu)

50 oddělení molekulární biologie katedry biochemie, PřF UP  různé expresní vektory s HIS-tagy na C a N konci pro expresi v E.coli  různé expresní kmeny E.coli  expresní vektory s HIS-tagy na C a N konci odvozené ze systému pPICZ a pGAPZ (Invitrogen) pro expresi v Pichia pastoris  expresní vektory pro expresi v Saccharomyces cerevisiae – replikační i pro integraci  expresní kmeny kvasinek Pichia pastoris a Saccharomyces cerevisiae  různé vektory pro transformaci jednoděložných i dvouděložných rostlin


Stáhnout ppt "Expresní systémy živé systémy využívající rekombinantních DNA technologií pro produkci bioorganických látek (především proteinů)"

Podobné prezentace


Reklamy Google