Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

UNCE 204021 Seminář UNCE 28.5.2012  UNIVERZITNÍ CENTRUM  „Experimentální patologie založená na genové manipulaci kmenových buněk“  4 cíle  4 senioři/14.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "UNCE 204021 Seminář UNCE 28.5.2012  UNIVERZITNÍ CENTRUM  „Experimentální patologie založená na genové manipulaci kmenových buněk“  4 cíle  4 senioři/14."— Transkript prezentace:

1 UNCE Seminář UNCE  UNIVERZITNÍ CENTRUM  „Experimentální patologie založená na genové manipulaci kmenových buněk“  4 cíle  4 senioři/14 juniorů

2 UNCE Rozpočet  Celkem 23,427 mil Kč ( )  Podpora (2012) : 3,3645 mil Kč  Dominantní složkou je mzdový fond  Rok 2012 : provozní náklady (175 tis Kč) kryjí náklady z Centra biomodelů  Projekt komplementuje PRVOUK, jež zajišťuje další prostředky pro platy a provoz. V neposlední řadě je projekt provázán s navazujícími granty.

3 UNCE Výsledky a jejich prezentace  Semináře 2x ročně (další bude ve 12h)  Prezentace výsledků - veřejná  Webové stránky slouží jako informační centrum a vytvářejí historii grantovému projektuhttp://unce1.lf1.cuni.cz/  Bude vytvořena tvář WEBu, jež bude upozorňovat na novinky – především prestižní publikace.

4 UNCE Cíl 1 Stopka et al.

5 UNCE Specifický cíl 1a Studium role genové transkripce a remodelace chromatinové struktury v diferenciaci kmenových buněk a příprava dalších myších transgenních modelů. Cíl 2b. Studium molekulárních mechanizmů buněčné transdiferenciace. Senior: T Stopka (1 a 2) Junioři: P Burda (2), V Pospíšil (2), N Čuřík (1), K Vargová (1) Další participace: P Vlčková (1), M Kapalová (1), T Zikmund (1)

6 UNCE Obecné principy  Experimentální hematologie: modelování funkce rozličných molekul, jež se účastní diferenciace kmenové buňky.  Myší transgenika: gene knockout (delece) a knock in (vnesení) v ES buňkách mechanizmem homologní rekombinace.

7 UNCE Molekulární úroveň  Transkripční faktory: PU.1 – hlavní regulátor diferenciace kmenové krvetvorné buňky, „leukemia suppressor“.  Chromatin remodelační faktory: Smarca5, skládá a rozkládá nukleozóm, účastní se dějů na DNA.  Postranskripční regulace: mikroRNA (inhibitory exprese).

8 UNCE Medicínská úroveň  Hematologické malignity: AML, CML, MDS, CLL – role vybraných molekul v downregulaci PU.1 (prognostický význam)  Epigenetická terapie (5-AZA u MDS): ovlivňuje krvetvorbu mechanizmem odblokování exprese některých tumor supresorových genů (např. PU.1).

9 UNCE Metodika  Experimentální modely: transgenní myši, derivované buněčné linie, genetická manipulace v buněčné linii.  Molekulární metodiky: vnesení nukleových kyselin do buňky, celogenomová analýza fenotypu, zobrazovací metodiky v myši, RNA FISH.

10 UNCE Role PU.1 u malignit krvetvorby  1) jaká je role 5-AZA v regulaci exprese genu PU.1 (Čuřík et al. 2011, Leukemia, IF:8,99). Chromatinová struktura genu PU.1 reaguje specificky na 5-AZA. Je možné využít testování odpovědi na 5-AZA in vitro na úrovni chromatinu (srovnání s OS pacientů).  2) je gen pro PU.1 mutován u MDS? (deep sequencing). Ovlivňuje hladina PU.1 agresivitu MDS a AML (myší model – Vlčková et al 2012) PhD studium od r. 2006, juniorem od 6/2012 N. Čuřík PhD studium od r (juniorkou během 2. ½ 2012) K. Vargová

11 UNCE Role Smarca5 v krvetvorbě  3) nepostradatelná role Smarca5 v krvetvorbě? Kondiciální delece v myši ukazuje na specifický defekt krvetvorby. (Kokavec et al. v přípravě)  4) testování role Smarca5 jako onkogenu – kondiciální aktivace transgenu (knock in) – aktuálně na úrovni rekombinace ES buněk (T. Zikmund).

12 UNCE Transdiferenciace krvetvorných buněk  5) role rozličných hladin PU.1 v inhibici onkogenních mikroRNA (miR-17-92) a v produkci odlišných krevních elementů. Genetický program PU.1 – cílové geny a jejich schopnost „senzovat“ odlišné hladiny TF.  6) role antagonizmu PU.1 a GATA-1 v regulaci liniové determinace. Jak 2 vzájemně se blokující transkripční faktory regulují produkci odlišných krevních elementů? PhD , Opletalova cena 1.LFUK za rok 2011 PhD , řešitel GAUK a od r GAČR postdoc V. Pospíšil P. Burda

13 UNCE Nejvýznamnější výstup  5-azacitidine in aggressive myelodysplastic syndromes regulates chromatin structure at PU.1 gene and cell differentiation capacity. Curik N, Burda P, Vargova K, Pospisil V, Belickova M, Vlckova P, Savvulidi F, Necas E, Hajkova H, Haskovec C, Cermak J, Krivjanska M, Trneny M, Laslo P, Jonasova A, Stopka T. Leukemia Feb 20. IF: 8,99 Teze publikace:  a) 5-AZA ovlivňuje chromatinovou strukturu a expresi genu PU.1  b) 5-AZA vlivem na PU.1 zapíná krvetvornou diferenciaci  c) míra represe PU.1 u MDS koreluje s přežíváním na 5- AZA – plánuje se klinické testování (AZA/G-CSF)

14 UNCE Výstupy projektu  Další publikace (jen citace s uvedením IF) 0  Pořádané odborné akce: Genes, Genetics & Genomics (G3) International Symposium on Gene Regulation in Normal and Pathologic States.  Celkový výsledek cíle: celkový počet prací s IF (1) a souhrnný IF (8,99).

15 UNCE Plánované aktivity Experimenty: Smarca5 - kondiciální delece v T buňkách (T Zikmund), Ctcf – interakce se Smarca5 (M. Kapalová), Smarca5 – kondiciální transgen v myši (T Zikmund) Publikace: Vlčková et al. (role inhibice PU.1 v agresivitě AML) těsně před odesláním Kokavec et al. před odesláním, zdržení při dokončování na straně kolaborátora (vliv kondiciální inaktivace Smarca5 v krvetvorbě) P. Vlčková

16 UNCE Cíl 2 Nečas et al.

17 UNCE Specifický cíl 2. Studium molekulárních mechanizmů transplantace krvetvorných kmenových buněk a mechanizmů buněčné transdiferenciace. Senior: Emanuel Nečas Junioři: Jana Michalová Katarina Forgáčová

18 UNCE Základní uvedení do problematiky specifického cíle  kmenová krvetvorná buňka  progenitorová krvetvorná buňka  niche spolu tvoří základní funkční jednotku krvetvorby

19 UNCE Základní uvedení do problematiky specifického cíle (molekulární úroveň) Molekulární úroveň interakcí v základní funkční jednotce je studována z metodických důvodů většinou nepřímo: 1. narušením rovnovážného stavu např. ozářením, cytostatiky 2. genovou manipulací (knock-out, knock-in)

20 UNCE Základní uvedení do problematiky specifického cíle (medicínská úroveň)  transplantace kostní dřeně  nádorová hematopoeza  kmenové buňky v regenerační medicíně všeobecně

21 UNCE Konkrétní vědecké otázky  1) podstata změněné zdatnosti (fitness) kmenových buněk myší UBC-GFP  2) podstata snížené fitness kmenových buněk z regenerované krvetvorné tkáně

22 UNCE Konkrétní vědecké otázky  3) obsazování a uzavírání nichí kmenovými a progenitorovými buňkami Terp53-/-  4) latentní přítomnost dárcovských kmenových a progenitorových buněk transplantovaných neozářenému příjemci

23 UNCE Konkrétní vědecké otázky  5)  6)

24 UNCE Metodika (experimentální modely)  transplantace krvetvorné tkáně normálním, submyeloablativně a myeloablativně ozářeným příjemcům, sledování úrovně chimerismu (A/B ev. C a D)

25 UNCE Metodika (molekulární metody)  mRNA a miRNA profiling  PCR specifických kandidátních mRNA (adhezivní molekuly) - v separovaných buňkách LSK (asi 50 tisíc/femur x asi 1000 buněk kmenových) - ve stromatu krvetvorné tkáně (zbavené krvetvorby ozářením)

26 UNCE Nejvýznamnější výstup  Minimálně 1 publikace v přípravě (před odesláním) či již vyšlá do 6 měsíců. Forgáčová et al: Timing of transplantation window... (BBMT) Forgáčová/Nečas: review (Folia Biol)  Teze publikace:  a)  b)  c)

27 UNCE Výstupy projektu  Další publikace (jen citace s uvedením IF)  Abstrakta a další výstupy.  Celkový výsledek cíle: celkový počet prací s IF a souhrnný IF.

28 UNCE Plánované aktivity (experimenty) - je dokončována analýza „transplantačního okna“ u letálně ozářených myší - pokračuje analýza myší UBC-GFP ◊ zpracování a interpretace mRNA profilu v kadaverózní krvetvorné tkáni postrádající ATP (Illumina)

29 UNCE Problémy, potřeba spolupráce... Illumina... V kadaverózí „umírající“ tkáni kosní dřeně se postupně snižuje zastoupení desítek, stovek, a tisíců specifických mRNA... Současně se ZVYŠUJE zastoupení skoro stejného počtu jiných mRNA... ?????

30 UNCE Cíl 3 Klener et al.

31 UNCE Specifický cíl č.3: Vývoj a studium myších modelů xenotransplantace lidských nádorových buněk leukémií a lymfomů Senior: doc. Jan Živný, Ph.D. Junioři: MUDr. Pavel Klener, Ph.D., MUDr. Jan Molinský, MUDr. Magdalena Klánová, MUDr. Bokang Maswabi

32 UNCE Základní uvedení do problematiky specifického cíle  Obecné principy -imunodeficientní myši umožňují engraftment buněčných linií lidských leukémií a lymfomů v myším organismu -růst xenotransplantátu v myším organismu umožňuje preklinické studium role mikroprostředí, šíření tumoru, novotvorby cév či experimentální in vivo terapii

33 UNCE Základní uvedení do problematiky specifického cíle  Molekulární úroveň 1. Bude studována změna genové exprese a fenotypu buněk rostoucích in vivo v porovnání s in vitro rostoucími liniemi 2. Bude studován vliv cílené změny exprese vybraných genů (např. adhezivních molekul) na engraftment, růst, šíření a neovaskularizaci xenotransplantovaných tumorů.

34 UNCE Základní uvedení do problematiky specifického cíle  Medicínská úroveň -myší model lidské leukémie a lymfomu nám umožní studium patogeneze lidských malignit na preklinickém modelu -myší model bude sloužit pro preklinické zhodnocení účinnosti vybraných protinádorových látek

35 UNCE Konrétní vědecké otázky  1) charakterizace engraftmentu a šíření buněk linií lymfomu z plášťových buněk (MCL) v jednotlivých myších orgánech pomocí imunohistochemie a průtokové cytometrie  2) studium genové exprese a fenotypu buněk MCL buněk získaných ex vivo z myších orgánů ve srovnání s in vitro rostoucími MCL liniemi.

36 UNCE Konrétní vědecké otázky  3) role exprese adhezivních molekul CD31/PECAM a CD44/Hermes v engraftmentu, růstu, šíření a neovaskularizaci MCL tumorů  4) role exprese VEGF receptorů (VEGFR1, 2, 3) v engraftmentu, růstu, šíření a neovaskularizaci MCL tumorů

37 UNCE Konrétní vědecké otázky  5) studium molekulárních mechanismů regulujících neovaskularizaci podkožních MCL tumorů  6) experimentální terapie MCL pomocí anti- angiogenních léčiv

38 UNCE Metodika  Experimentální modely:  Počítá se se stabilní kohortou cca myšek v pokuse + cca myšek v chovném jádře  Molekulární metodiky:  příprava transgenních linií se stabilně zvýšenou či sníženou expresí vybraných genů  studium změn genové exprese pomocí real-time RT-PCR a mikročipů  studium proteinové exprese pomocí western blottingu a průtokové cytometrie  izolace buněčných subpopulací pomocí magnetických kolon

39 UNCE Nejvýznamnější výstup  Minimálně 1 publikace v přípravě (před odesláním) či již vyšlá do 6 měsíců: Mouse model of human mantle cell lymphoma (MCL) for the study of MCL biology and for preclinical assessment of experimental treatment approaches.  Teze publikace:  a) Myší model MCL je biologicky podobný agresivní blastoidní variantě MCL u člověka  b) MCL buňky rostoucí v myši mají odlišný fenotyp v porovnání s MCL buňkami rostoucími in vitro  c) Experimentální terapie blastoidního MCL: cisplatina vykazuje významný protilymfomový efekt v terapii blastoidního MCL

40 UNCE Výstupy projektu  Další publikace (jen citace s uvedením IF)  Zatím ne  Abstrakta a další výstupy.  Zatím ne  Celkový výsledek cíle: celkový počet prací s IF a souhrnný IF.

41 UNCE Plánované aktivity Experimenty: 1. Charakterizace myšího modelu MCL za použití xenotransplantace primárních buněk izolovaných od pacientů s blastoidním MCL. Primární buňky, které nerostou in vitro, lze „propagovat“ pomocí sériových transplantací v imunodeficientních myších  vliv mikroprostředí myšího organismu= experimentální model blíže biologii MCL u člověka. 2. Charakterizace dvou nových linií MCL odvozených od 2 pacientů s MCL: UPF1E, UPF2A. Včetně xenotransplantací do imunodeficientních myší. Publikace: zatím ne.

42 UNCE Cíl 4 Šedý et al.

43 UNCE Studium kmenových buněk ve vztahu k doplňování rozličných tkání Senior: Doc. René Foltán Junioři: Dr. Jiří Šedý Dr. Jiřina Nieblerová Dr. Erika Kužmová unce204021

44 UNCE Základní uvedení do problematiky specifického cíle  Cílem projektu je posoudit možnosti implantace kmenových buněk a osteoindukčních biomateriálů do kostěných defektů na modelu laboratorního potkana.

45 UNCE Základní uvedení do problematiky specifického cíle  MSCs reprezentují v současné době roli hlavního kandidáta v regenerativní medicíně, včetně augmentace kosti, pomocí přímých i nepřímých mechanismů, kterými potencují regeneraci kosti.  Lepší pochopení těchto mechanismů umožní zdokonalit techniky lokální terapie kostních defektů, optimalizaci jejich využití, indikací a napomůže maximální využití jejich společných účinků s biomateriály

46 UNCE Základní uvedení do problematiky specifického cíle  MSCs mají obrovský terapeutický potenciál, který je zatím jen velmi málo využitý.  Neexistují žádné spolehlivé selektivní markery pro MSCs.  I proto jsou vlastnosti MSCs stále neprobádané.  Jedna z teorií o MSCs předpokládá „MSCs niche“ centralizovanou v jednom orgánu/tkáni, odkud jsou MSCs mobilizované a migrují k místu léze, ale zabezpečují i neustálou fyziologickou obnovu tkání.

47 UNCE Základní uvedení do problematiky specifického cíle  Incidence MSCs v tkáních není dostatečná a pro terapeutické cíle je nutná jejich expanze ex vivo.  MSCs izolované z různých tkání sa mírně od sebe liší nejen fenotypově, ale i terapeutickým potenciálem.  Podmínky in vitro kultivace zásadně ovlivňují přežívání, proliferaci, diferenciaci a jiné vlastnosti MSCs in vivo.  Stále přibývající práce o 3-D kultivaci MSCs in vitro ukazují, že 2-D kultury velmi zkreslují přirozené projevy MSCs (produkce jiných signálních molekul, exprese jiných povrchových markerů,...).

48 UNCE Konkrétní vědecké otázky  1) Jak nejlépe MSCs kultivovat  2) Jak nejlépe MSCs a biomateriály aplikovat na místo určení

49 UNCE Konkrétní vědecké otázky  3) Jaká doba je nutná k reparaci kostěného defektu  4) Jaká je kvalita reparované kosti

50 UNCE Konkrétní vědecké otázky  5) Jaký je osud MSCs v lézi

51 UNCE rMSC hMSC P0P1P2 CEM-OSTETIC HA scaffolds CD105 +, CD73 +, CD90 + and CD45 -, CD34 -, CD14 - or CD11b -, CD79 α -, HLA-DR - 8 weeks 1.5x5x1.5mm A Bone defect only B Bone defect with HA C B+hMSC (0,5mil.) D B+hMSC (5mil.) E B+rMSC (0,5mil.) F B+rMSC (5mil.) C D CD AB E Metodika a předběžné výsledky

52 UNCE Results-histomorphomerical analysis * Error bars show SEM.

53 UNCE Results Representative Micro CT scan of vertebral deffect (Group 3) Representetive Micro CT scan of vertebral deffect (Group 4)

54 UNCE Nejvýznamnější výstup  Bone scaffold combined with mesenchymal stem cells in the treatment of vertebral body defects. Vaněček V, Klíma K, Kohout A, Foltán R, Jiroušek O, Šedý J, Štulík J, Syková E. V přípravě.  Teze publikace: a) hMSCs v kombinaci s CEM-Ostetic jsou bezpečnou modalitou v reparaci kosti b) hMSCs v kombinaci s CEM-Ostetic mají vysoký reparativní potenciál v kosti c) optimální je velké množství buněk (5 milionů)

55 UNCE Výstupy  1 původní práce (+2 v přípravě)  1 monografie  6 kapitol v monografii  1 habilitační práce  2 publikace menšího rozsahu  2 pořádané odborné akce

56 UNCE Plánované aktivity Experimenty: 1. Detailní studium osudu MSCs v lézi organismu 2. Převedení terapeutického protokolu do autologního režimu Publikace: zejména další primární publikace


Stáhnout ppt "UNCE 204021 Seminář UNCE 28.5.2012  UNIVERZITNÍ CENTRUM  „Experimentální patologie založená na genové manipulaci kmenových buněk“  4 cíle  4 senioři/14."

Podobné prezentace


Reklamy Google