Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

HPLC vývoj metody 1 Principy vývoje HPLC metod 1. Definice problému 2. Experiment s hlavními proměnnými 3. Vyhodnocení 4. Optimalizace 5. Řešení problémů.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "HPLC vývoj metody 1 Principy vývoje HPLC metod 1. Definice problému 2. Experiment s hlavními proměnnými 3. Vyhodnocení 4. Optimalizace 5. Řešení problémů."— Transkript prezentace:

1 HPLC vývoj metody 1 Principy vývoje HPLC metod 1. Definice problému 2. Experiment s hlavními proměnnými 3. Vyhodnocení 4. Optimalizace 5. Řešení problémů

2 HPLC vývoj metody 2 Definice problému Jaký je účel? Analytický Preparativní Jaké jsou vlastnosti analytu a vzorku? Náboj – pozitivní / negativní Hydrofobicita Affinita - “zámek a klíč” vazebná místa Rozpustnost & stabilita pH, iontová síla, organická rozpouštědla Molekulová hmotnost

3 HPLC vývoj metody 3 Analytická x preparativní Analytical Requirements Linearity Precision Accuracy Sensitivity Assay reproducibility Robustness Preparative Requirements Recovery Product purity Capacity Costs Scale up Process throughput Speed

4 HPLC vývoj metody 4 Vývoj metody Výběr způsobu separace mapa pH Optimalizace gradientové eluce  Spád gradientu  Koncentrace mobilní fáze Předmět sledování  Zahlcení: šířka a tvar píku

5 HPLC vývoj metody 5 Běžné způsoby Reverzní fáze  Stacionární fáze hydrofobní, mobilní hydrofilní Kolony: silikagel, polystyrene kovalentně modifikovaný alkylovými řezězci 3-18 C  Př. octadecylsilane (ODS) - C18 Mobilní fáze: pufrovaná voda + organická rozpouštědla(propanol CH3CN, CH3OH) gradientová eluce Ion-Exchange (IEC)  Ion exchange interakce mezi kationty nebo anioty analytu a stacionární fáze s opačným nábojem Stacionární fáze: polystyren, silikagel modifikovaný funkčními skupinami, např. kvartérní aminy Mobilní fáze: pufry obsahující vzrůstající koncentrace solí (NaCl, MgCl 2, K 3 PO 4, NH 4 SO 4 ) Gradientová eluce

6 HPLC vývoj metody 6 Vyhodnocení Rozlišení  Stupeň separace mezi analyty a dalšími látkami přítomnými ve směsi Výtěžnost  Hmotnostní výtěžnost  Aktivitní výtěžnost Kapacita

7 HPLC vývoj metody 7 Strategie vývoje metody pro izokratickou a gradientovou eluci při RP HPLC

8 HPLC vývoj metody 8 Přehled vývoje metod: Začni při nízkém pH, postupuj směrem k vyššímu pH

9 HPLC vývoj metody 9 Základní rozlišení R = V N 4 k' k'+1 ( ) -1-1 Separation  Retention 2 < K < 10 R   Resolution Efficiency Avg. = Best = Stationary Mobile phase Length Particle size % H2O  Rovnice pro izokratickou eluci

10 HPLC vývoj metody 10 Doporučené cíle vývoje metody Odpovídající rozlišení pro všechny píky, Rs  1.7 Retence prvního píku by měla být minimálně k=1 Doba analýzy kratší než 30 minut, raději 20 minut Robustnost a spolehlivost method Použití pufrované mobilní fáze – nejdříve zkusit nízké pH

11 HPLC vývoj metody 11 Kvalita separace Kritické rozlišení – rozlišení mezi nejhůře separovaným párem píků analyzovaných látek na chromatogramu

12 HPLC vývoj metody 12

13 HPLC vývoj metody 13

14 HPLC vývoj metody 14

15 HPLC vývoj metody 15

16 HPLC vývoj metody 16

17 HPLC vývoj metody 17

18 HPLC vývoj metody 18

19 HPLC vývoj metody 19

20 HPLC vývoj metody 20

21 HPLC vývoj metody 21

22 HPLC vývoj metody 22

23 HPLC vývoj metody 23

24 HPLC vývoj metody 24

25 HPLC vývoj metody 25

26 HPLC vývoj metody 26

27 HPLC vývoj metody 27

28 HPLC vývoj metody 28

29 HPLC vývoj metody 29

30 HPLC vývoj metody 30

31 HPLC vývoj metody 31

32 HPLC vývoj metody 32

33 HPLC vývoj metody 33

34 HPLC vývoj metody 34

35 HPLC vývoj metody 35

36 HPLC vývoj metody 36

37 HPLC vývoj metody 37

38 HPLC vývoj metody 38

39 HPLC vývoj metody 39

40 HPLC vývoj metody 40 pH – významný parametr pří vývoji metody

41 HPLC vývoj metody 41 pH – důležitý parametr při vývoji metody Retence ionizovatelných sloučenin je výrazně ovlivněna pH Ionizovatené sloučeniny (kyseliny a báze) mohou být analyty nebo součásti matrice Přesná kontrola pH zlepšuje reprodukovatelnost metody Rozsah pH 1 – 12 zajišťuje maximální flexibilitu při vývoji metody

42 HPLC vývoj metody 42 Základem vývoje metody je změna retence ionizovatelných sloučenin změnou pH Nenabité analyty mají lepší retenci (kyseliny při nízkém pH a báze při vysokém pH) Silanolové skupiny na silikagelu ionizují při středním pH, se vzrůstající retencí bazických analytů (např. možné ion-exchange interakce) Výběr mobilní fáze a typu kolony pro optimalizaci retence a selektivity při vývoji metody

43 HPLC vývoj metody 43 Vývoj metody pro základní sloučeniny ve vztahu k pH Region A Logical method development starts at low pH, where the underlying silica silanols on a RP-HPLC column are protonated. This means that basic compounds (of great interest in the pharmaceutical and other industries) do not tail on the underlying silica support because there is no negatively charged silanols. Also at low pH, retention times are short since most basic compounds are charged. Acidic compounds may be in their protonated form and have increased retention. Retention times are usually stable with small changes in pH, producing a robust method Volatile mobile phases, such as formic acid or TFA, are often used at low pH with LC/MS.

44 HPLC vývoj metody 44 Vývoj metody pro základní sloučeniny ve vztahu k pH Region B At neutral pH, care must be taken not to develop methods around the pKa of the analyte, as this can lead to large changes in retention with small changes in pH The underlying silica surface becomes charged (approximately pH 4- 6); thus, these silanols can cause basic compounds to tail These silanols must be “covered up” by endcapping the column, using additives such as TEA (less desirable) or using “polar” bonded phases As pH increases, silica dissolution must be prevented by heavily encapping the column This pH region (for the compound’s pKa) will change with each analyte As pH increases, silica breakdown must be prevented by innovative bonding chemistry and use of the proper silica

45 HPLC vývoj metody 45 Vývoj metody pro základní sloučeniny ve vztahu k pH Region C In this region, basic compounds are in their free base form, giving them more retention and different selectivity; thus, complex mixtures of basic compounds may be easier to separate at high pH Retention changes little in this region - thus robust methods can be developed; retention is longer, but this may be the only region where some basic compounds will separate At high pH silica breakdown must be prevented by innovative bonding chemistry and use of the proper silica

46 HPLC vývoj metody 46 Proč vyvíjet metodu při nízkém pH? Kyseliny jsou protonované – maximální retence Silanolové skupiny jsou protonizované, čímž jsou minimalizovány ion-exchange interakce s bazickými sloučeninami  Dobrý tvar píku  Reprodukovatelnost v dlouhém období Výborný výběr mobilní fáze

47 HPLC vývoj metody 47 pH je hlavním parametrem při výběru stacionární fáze At low pH  bonded phase breaks down by hydrolysis of the siloxane bond  breakdown is faster at higher temperature  breakdown is faster for shorter-chain phases (C3, CN, Phenyl)

48 HPLC vývoj metody 48 With Dimethyl-Substituted Phases, Unprotected Siloxane Bonds Are Hydrolyzed at Low pH Shorter chain phases hydrolyze more easily than longer chain phases. For example, R = C18 is more stable than R = C3.

49 HPLC vývoj metody 49 Short-Chain, Dimethyl Bonded Phases Are Especially Unstable at Low pH (e.g., pH 2.0) Kirkland, J.J., J.L. Glajch, and R.D. Farlee, Analytical Chemistry (1989), 61, 2.

50 HPLC vývoj metody 50 Sterically Protected, Monofunctional Silane Bonding HYDROLYTICALLY UNSTABLE CONVENTIONAL HYDROLYTICALLY STABLE STERICALLY PROTECTED

51 HPLC vývoj metody 51 ZORBAX Products Have Unique Chemistry for Extended Column Lifetime at Different pH Ranges StableBond (5 phases: C18, C8, C3, CN, Phenyl)  designed for low pH  sterically protected silanes  non-endcapped  highly temperature stable  short-chain phases very stable  Extremely low LC/MS bleed Low pH Range

52 HPLC vývoj metody 52 Method Development Scheme Start at Low pH

53 HPLC vývoj metody 53 Recommended Starting Conditions for RP- HPLC Method Development Approach

54 HPLC vývoj metody 54 Choose StableBond at Low pH Superior column lifetime due to patented sterically protecting bonding technology Fully-hydroxylated ultra-pure silica improves peak shape Five different 80Å bonded-phases – SB-C18, SB-C8, SB-CN, SB- Phenyl, SB-C3 – provide optimum selectivity with exceptional lifetime Four different 300Å bonded-phases for selectivity options with protein and peptide separations

55 HPLC vývoj metody 55 Method Development – SB-C18 at Low pH Separation of Steroids Method development scheme recommends starting with SB-C18 at low pH, which provides an excellent separation of these steroids and impurities. Column:ZORBAX Rapid Resolution SB-C18, 4.6 x 75 mm, 3.5 µm Mobile Phase:50% ACN 50% 20 mM NaH 2 PO 4, pH 2.8 Flow Rate:1.0 mL/min Temperature: RT Detection: UV 254 nm Sample:1. Estradiol 2. Ethynylestradiol 3. Dienestrol 4. Norethindrone

56 HPLC vývoj metody 56 Method Development – SB-C18 at Low pH Separation of Plant Extract Column: ZORBAX Rapid Resolution SB-C x 75 mm, 3.5 µm Mobile Phase: 22% ACN 78% NaH 2 PO 4, pH 2.5 Flow Rate: 1.0 mL / min Temperature: RT Detection: UV 254 nm Sample:1. Caffeic acid 2. Impurity 3. Luteolin 4. Naringenin 5. Apigenin To obtain k=1 for caffeic acid requires 22 minute analysis time Flavones, Flavanones, and Phenolic Esters

57 HPLC vývoj metody 57 Method Development – Change Organic Modifier : Separation of Plant Extract Column: ZORBAX Rapid Resolution SB-C x 75 mm, 3.5 µm Mobile Phase: 40% MeOH 60% NaH 2 PO 4, pH 2.5 Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: RT Detection: UV 254 nm Sample:1. Caffeic acid 2. Impurity 3. Naringenin 4. Luteolin 5. Apigenin Methanol as the organic modifier changes selectivity and increases the analysis time. Flavones, Flavanones, and Phenolic Esters

58 HPLC vývoj metody 58 Method Development – Change Bonded- Phase Separation of Plant Extract on SB-CN Flavones, Flavanones, Phenolic Esters Column: ZORBAX Rapid Resolution SB-CN, 4.6 x 75 mm, 3.5 µm Mobile Phase: ACN: NaH 2 PO 4, pH 2.5 Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: RT Detection: UV 254 nm Sample: 1. Caffeic acid 2. Impurity 3. Luteolin 4. Naringenin 5. Apigenin 22% ACN: 78% Buffer 25% ACN: 75% Buffer SB-CN with stronger mobile phase reduces analysis time by 50% and maintains retention of k=1 on 1 st peak.

59 HPLC vývoj metody 59 SB-CN Optimizes Retention and Resolution Phytoestrogens and Isoflavones SB-CN reduces analysis time by 50% and increases retention of early eluting peaks. Method development procedure followed to get to this point. SB-C18 SB-CN Columns: 4.6 x 75 mm, 3.5 µm Mobile Phase: 30% ACN: 70% NaH 2 PO 4, pH 2.5 Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: 35°C Sample: 1. Estriol 2. Daidzen 3. Quercetin 4. Genistein 5. Diethylstilbestrol

60 HPLC vývoj metody 60 Why Develop RP-HPLC Methods at Mid- pH? Compounds of interest are unstable at low pH Improved solubility of analytes at mid pH Increase retention of basic compounds May have better selectivity in the pH range 3 – 8

61 HPLC vývoj metody 61 pH is a Major Consideration in Bonded Phase Selection At intermediate and high pH  bonded phase breaks down by hydrolysis of silica

62 HPLC vývoj metody 62 Method Development Scheme Mid pH Range

63 HPLC vývoj metody 63 Recommended Conditions for Mid-pH Method Development

64 HPLC vývoj metody 64 Choose Eclipse XDB for Mid-pH Long lifetime at mid-pH with dense bonding and double endcapping Strong silica for long lifetime Double endcapping provides excellent peak shape Three different bonded-phases (C18, C8, Phenyl) for selectivity optimization

65 HPLC vývoj metody 65 Good Resolution with Eclipse XDB-C18 at Mid-pH SB-C18, 4.6 x 75 mm, 3.5 µm Eclipse XDB-C18, 4.6 x 75 mm, 3.5 µm Mobile Phase: 20% Methanol: 80% 20 mM phosphate buffer Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: RT Detection: UV 254 nm Sample: 1. Nizatidine 2. Famotidine 3. Cimetidine 4. Pirenzipine Better selectivity and improved retention occur at pH 7. pH 3 pH 7 10 mM TEA

66 HPLC vývoj metody 66 Eclipse XDB Selectivity Options Maximize Retention at pH 7 Eclipse XDB-Phenyl provides improved retention of these procainamides. Columns: 4.6 x 150 mm, 5 µm Mobile Phase: 10% ACN: 90% Na 2 HPO 4, pH 7 Flow Rate: 1.5 mL/min Temperature: 35°C Detection: UV 254 nm Sample: 1. Procainamide 2. n-Acetylprocainamide 3. n-Propionylprocainamide Eclipse XDB-C18 Eclipse XDB-Phenyl Eclipse XDB-C

67 HPLC vývoj metody 67 Bonus-RP Provides Alternate Selectivity at Mid-pH Polar alkyl-amide bonded-phase for unique selectivity Improves peak shape of basic compounds Triple-endcapped for good lifetime at mid-pH Enhanced low-pH stability (sterically protecting bonding) for alternate selectivity at low pH Compatible with 100% aqueous mobile phases

68 HPLC vývoj metody 68 Why Develop RP-HPLC Methods at High pH? Compounds of interest not soluble at lower pH Compounds of interest not stable at lower pH Increase retention of basic compounds by analyzing them in non- charged form Improve selectivity

69 HPLC vývoj metody 69 Silica–Based HPLC Columns are Now a High pH Choice New technologies to protect silica from dissolution provide good lifetimes at high pH Superior efficiency of silica-based columns provides high resolution Robust methods can be established using the same parameters as used at low pH

70 HPLC vývoj metody 70 Choose Extend-C18 for High pH Patented bidentate C18-C18 bonding for superior high pH stability – up to pH 11.5 Improved performance over polymeric columns Excellent peak shape with double endcapping LC/MS at high pH (ammonium hydroxide) with high efficiency Silica support Extend-C18 Bidentate Structure

71 HPLC vývoj metody 71 Method Development at High pH

72 HPLC vývoj metody 72 Recommended Conditions for High pH Method Development

73 HPLC vývoj metody 73 Column: ZORBAX Extend-C x 150 mm Flow Rate:0.5mL/min. Mobile Phase:Panel A: 55% Methanol / 45% 50 mM Pyrrolidine Buffer, pH 11.5 Panel B: 75% Methanol / 25% 50 mM Pyrrolidine Buffer, pH 11.5 Flow Rate:Panel A: 1.5 mL / min.; Panel B: 1.0 mL/min. Temperature:40°C Detectoion:UV at 215 nm Separate Basic Compounds in Their Free Base Form at High pH Separation of ß-Blocker Drugs with Zorbax Extend-C18 at pH 11.5 Separation of Antidepressants Using Zorbax Extend- C18 at pH 11.5 Doxepin Nortriptyline Imipramine Amitriptyline Trimipramine  1. Pindolol 2. Metoprolol 3. Oxyprenolol 4. Toluene 5. Propranolol N = 11,500 A s = 0.99 N = 14,060 A s = A B

74 HPLC vývoj metody 74 Mobile Phase Considerations for LC/ESI-MS of Proteins/Peptides TFA forms ion pair and suppresses signal Several solutions to for a better signal  dilute with a different acid post column (the “TFA fix”)  lower TFA concentration  use a different acid as mobile phase  use a different pH range and column

75 HPLC vývoj metody 75 High pH Increases Retention of Antihistamines The retention of this sample of basic compounds increases at high pH. Column: ZORBAX Extend-C18, 4.6 x 150 mm, 5 µm Mobile Phase: See Below Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: RT Detection: UV 254 nm Sample: 1. Maleate 2. Scopolamine 3. Pseudoephedrine 4. Doxylamine 5. Chlorpheniramine 6. Triprolidine 7. Diphenhydramine pH 7 30% 20 mM Na 2 HPO 4 70% MeOH pH 11 30% 20 mM TEA 70% MeOH t R = 8.5t R = 11.4

76 HPLC vývoj metody 76 Extend-C18 Provides High Efficiency and Good Peak Shape In comparison to polymeric columns, the Extend-C18 has superior efficiency and peak shape Mobile Phase: 65% 20 mM TEA, pH 11: 35% MeOH Temperature: RT Detection: UV 254 nm Sample: 1. Pyridoxine 2. Pyridine 3. n-Methylbenzylamine 4. Procainamide 5. n-Acetylprocainamide Polymeric-Based Column 4.0 x 250 mm, 5 µm Flow Rate: 0.5 mL/min Extend-C x 250 mm, 5 µm Flow Rate: 1.0 mL/min

77 HPLC vývoj metody 77 Summary of Phase Selection 1. Choose reversed-phase stationary phase based on separation requirements of your analytes and optimum column lifetime. - Low pH, 1-4 (ZORBAX StableBond) - Intermediate pH, 3-8 (ZORBAX Eclipse XDB) - High pH, 7-12 (ZORBAX Extend C18) - Basic compounds, pH 3-8 (ZORBAX Bonus) 2. If possible, always use low pH values since best chromatography for ionizable compounds; if not, use intermediate pH and doubly end capped packing; if insufficient retention, then choose high pH with bidentate packing 3. Choose smallest particle size consistent with efficiency needs; use Type B sol-gel silica 4. Optimize solvent selection and composition, buffer type, buffer concentration, and temperature; add competing base, if needed

78 HPLC vývoj metody 78 Recommended Buffer Choices for High pH Pyrrolidine – 12.3 Triethylamine (TEA) – methyl-piperidine – 11.3 glycine – 10.8 TRIS – 9.1 Borate – 10.2 Ammonia – 10.2 Diethylamine – 11.5 Buffer pKaEffective pH range

79 HPLC vývoj metody 79 Selektivita kolon

80 HPLC vývoj metody 80 Selektivita kolon

81 HPLC vývoj metody 81 Selektivita kolon

82 HPLC vývoj metody 82 Selektivita kolon

83 HPLC vývoj metody 83 Selektivita kolon

84 HPLC vývoj metody 84

85 HPLC vývoj metody 85 PROBLÉMY PŘENOSU HPLC METOD A JEJICH VHODNÉ KOREKCE

86 HPLC vývoj metody 86 Při přenosu publikované HPLC metody na jiné pracoviště nastávají mnohdy problémy s interpretací separace sledovaných analytů a nastává problém vůbec reprodukovat publikovanou metodu. A – původní laboratoř, B – další laboratoř

87 HPLC vývoj metody 87 Chromatogram A znázorňuje původní publikovanou metodu Chromatogram B - po přenosu metody do jiné laboratoře Je zřejmé, že nedochází k separaci analytů 5,6 - rozlišení RS < 1,5 Existuje několik příčin proč nedochází k dokonalé separaci: a) chromatografický systém není dostatečně ekvilibrovaný b) došlo ke změně chromatografické kolonydošlo ke změně chromatografické kolony c) změna chromatografického (HPLC) systémuzměna chromatografického (HPLC) systému d) změna v chromatografickém postupuzměna v chromatografickém postupu Nedostatečnou ekvilibraci chromatografické kolony jako hrubou chybu vyloučíme a dále budeme rozebírat pouze poslední tři možné příčiny

88 HPLC vývoj metody Změna chromatografické kolony Změnou kolony (jiný výrobce, jiná šarže) zpravidla dojde ke změně: a) účinnosti kolony (počet teoretických pater, n) b) selektivity (retenční poměr, r 12 ) Proto je vhodné při validaci metody určit chromatografické parametry kolony, které vyhovují pro danou chromatografickou separaci: a) účinnost kolony b) selektivitu c) silanolovou aktivitu Testy chromatografických charakteristik stacionární fáze: - kapacita kolony (účinnost) – k pentylbenzenu, n pentylbenzenu - hydrofobicita - silanolová aktivita Validace metody na zvolené chromatografické koloně Určení vhodné alternativní chromatografické varianty. Metoda maximální chromatografické variability, která zahrnuje: 1. optimalizaci chromatografických podmínek 2. předvídání použití různých chromatografických kolon 3. výběr podobných kolon

89 HPLC vývoj metody Optimalizace chromatografických podmínek Sledování vlivu teploty a složení mobilní fáze (% organické fáze nebo strmost gradientu) na RS nebo r12 (vícenásobnou regresí se získá RS mapa akceptovatelných rozlišení při daných chromatografických podmínkách) Při změně rozlišení RS - určení chromatografické podmínky, které budou vyhovovat požadovanému rozlišení. Optimalizace chromatografických podmínek a aplikace na dvě stejné kolony různé šarže

90 HPLC vývoj metody Variabilita chromatografických kolon Obdobně jako u optimalizace chromatografických podmínek se optimalizují chromatografické kolony Pro alternativní kolony a pak dostáváme nejen chromatografické podmínky pro používanou kolonu, ale i pro alternativní chromatografickou kolonu. Určením tzv. RS map a jejich překryvem pro dvě různé kolony získáme ihned přehled, jak bude vypadat separace na alternativní koloně. Variabilita chromatografických kolon a určení RS map

91 HPLC vývoj metody Výběr podobných kolon K celkové selektivitě stacionární fáze přispívají: kapacitní faktor k a dále hydrofobicita (H), stérická selektivita (shape selektivity; S), silanolová aktivita (non-ionized silanol acidity nebo také silanol group capacity, A), kolonová basicita (column basicity; B) a iontově-výměnná kapacita (cation-exchange capacity; C). Pro logaritmus kapacitního faktoru pak platí: Kde κ, α, β,δ, jsou příspěvky solutu a H, S, A, B a C jsou příspěvky stacionární fáze a kde je kapacitní faktor daný distribuční konstantou a fázovým poměrem. Příspěvek hydrofobicity H souvisí s nespecifickými interakcemi solutu se stacionární fází (methylenová selektivita α CH2 ), příspěvky silanolové aktivity A a kolonové basicity B souvisí s možností tvorby vodíkových vazeb mezi solutem a zbytkovými silanolovými skupinami silikagelu. Určením selektivity různých chromatografických kolon (Tanakovy a Engelhardtovy testy) tak můžeme získat přehled o podobných kolonách, které je možné použít pak jako alternativní kolony ke koloně používané (validované).

92 HPLC vývoj metody Změna HPLC systému nebo HPLC procedury Změna HPLC systému vede ve většině případech ke změnám: 1. mrtvého objemu systému (při gradientu mobilní fáze) 2. změna mimokolonových příspěvků k rozšíření chromatografické zóny 2.1 Mrtvý objem systému Změna mrtvého objemu systému (konstrukce pumpy, změna vnitřního průměru kapilár) vede ke změně mrtvého objemu systému, která může mít vliv na strmost gradientu (zpoždění gradientu, které má vliv na separaci kritických analytů). Na separaci má vliv i tvorba gradientu – změna tvorby gradientu z nízkotlakého gradientu na vysokotlaký vede ke zpoždění gradientu a to má pak vliv na separaci kritických analytů. 2.2 Mimokolonové příspěvky Mimokolonové příspěvky k rozšíření chromatografické zóny mají vliv na účinnost systému a změna objemu nástřiku, objemu cely detektoru, vnitřního průměru kapilár nebo jejich délky, může mít vliv na účinnost kolony a to vede ke snížení rozlišení kritických analytů.

93 HPLC vývoj metody Změna v chromatografickém postupu Ke změně v chromatografickém postupu (metody) může dojít: a) ve změně složení mobilní fáze (změna objemové frakce organického rozpouštědla, pH, koncentrace aditiv [pufry, iontové páry]) b) změnou teploty na chromatografické koloně c) změnou gradientu (použití jiného tvorby gradientu, přechod z vysokotlakého gradientu na nízkotlaký a naopak)


Stáhnout ppt "HPLC vývoj metody 1 Principy vývoje HPLC metod 1. Definice problému 2. Experiment s hlavními proměnnými 3. Vyhodnocení 4. Optimalizace 5. Řešení problémů."

Podobné prezentace


Reklamy Google