Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Současné trendy v klinické imunologii a sérologii JAN MARTINEK.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Současné trendy v klinické imunologii a sérologii JAN MARTINEK."— Transkript prezentace:

1 Současné trendy v klinické imunologii a sérologii JAN MARTINEK

2 OSNOVA Základní principy metod v imunologii a sérologii Imunoglobuliny Problematika infekční sérologie (vybrané infekční agens)

3 Principy metod v imunologie a sérologii - DĚLENÍ METOD Humorální Buněčné

4 Metody nefelometrie a turbidimetrie Stanovení: proteiny akutní fáze, složky komplementu, podtřídy IgG Princip: měření intenzity světla precipitace v roztoku – přímé měření množství precipitátu - zákal kvantitativní stanovení (kalibrační křivka)

5

6 Elektroforéza Stanovení: Orientační informace o změnách v kvantitativním zastoupení jednotlivých frakcí imunoglobulínů - především Princip: Proteiny mají el. náboj podle náboje se rozdělí v elektrickém poli (albumin, , ,  - frakce ). možnost denzitometrické kvantifikace

7 E L E K T R O F O R É Z A

8 I MUNOFIXACE I M U N O F I X A C E

9 Metody – EIA Stanovení: infekční sérologie, autoprotilátky, tumor. Markery, spec. IgE … Princip: Specifická interakce mezi antigenu a protilátky s následným stanovením Typy: ELISA, FEIA, ELISPOT, CLIA,, CLIA, ECLIA, MEIA …

10 Metoda – ELISA Princip: komplex Ag - Ab detekován sekundární protilátkou značenou enzymem (křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza) komplex Ag – Ab je vázán na imunosorbent, nenavázané Ag (Ab) se odstraní promytím vysoká citlivost (  1ng/l)

11 ELISAprůkazantigenu ELISA – průkaz antigenu

12 TYPICKÝ VÝSLEDEK STANOVENÍ SPECIFICKÝCH PROTILÁTEK TECHNIKOU ELISA

13 METODA CLIA – ADVIA CENTAUR

14 Metoda – WB, Imunodot Stanovení: Infekčních, autoimunitních, spec. IgE …

15 WESTERN BLOT (IMUNOBLOT)

16 Metoda – IFA Stanovení: Především autoimunitních parametrů a dále infekční agens

17 NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE

18 Jaderné autoantigeny polynukleotidy histony ribonukleoproteiny antigeny jadérek centroméra další antigeny Orgánově nespecifické antigeny cytoplazmy buněčné organely antigeny cytoskeletu další antigeny Antigeny asociované s dělením buňky centriola dělící vřeténko separační zóna buňky Autoprotilátky na HEp-2 buňkách :

19 Komplement fixace a hemaglutinace komplement-fixační reakce je založena na vyvazování komplementu z reakčních směsí specifickými komplexy Ag s Ab – spotřeba komplementu. V druhém kroku je stanovena hemolytická aktivita komplementu (nepřítomnost protilátky se projeví lýzou). Testem jsou prokazovány směsné protilátky (nelze samostatně prokázat např. IgM). aglutinace na nosičích je precipitace převedená na aglutinaci, nejčastěji latexová aglutinace nebo pasivní hemaglutinace (HA). Všechny typy aglutinace na nosičích jsou vysoce citlivými reakcemi k důkazu protilátek.

20 NEPŘÍMÁ HEMAGLUTINACE

21 Testy Buněčné imunity Funkční testy leukocytů Stanovení počtu buněk

22 Funkční testy Fagocytosa – od metod diagnostikovaným pod mikroskopem až po aplikace na průtokovým cytometrem Fagocytosa aplikace průtoková cytometrie – využití principu, že při fagocytoze vznikají kyslíkové radikály → oxidace dihydrorodaminu na rodamin (fluorescence)

23 Funkční testy Basotest Aktivita NK buněk Blastická transformace lymfocytů

24 Stanovení počtu Význam: především diagnostika imunodeficitů a leukemií

25 vrchol současných možností analýzy buněčných suspenzí částice jsou v laminárním proudění usměrněny do řady cytometrie určuje: - počet - velikost (FS) -„morfologii“ buněk (SS) - přítomnost fluorescenčního signálu (FL) údaje získané pro jednotlivé buňky jsou vyhodnoceny počítačem PRŮTOKOVÁCYTOMETRIE PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE

26

27 Fluorochrom je konjugován s primární protilátkou

28 Vyjadřování výsledků - EIA metody Index pozitivity – Cut off (referenční sérum) 0-0,9 – negativní 0,9-1,1 – hraniční >1,1 - pozitivní Kalibrační křivka – standardy

29 Vyjadřování výsledků - IFA metody Subjektivní hodnocení, komentář Hraniční Slabě pozitivní Pozitivní Silně pozitivní

30 Vyjadřování výsledků – metody WB, Imunodot Semikvantitativní hodnocení, komentář Subjektivní hodnocení v kombinaci se software

31 Vyjadřování výsledků – průtoková cytometrie Procentuální vyjádření jednotlivých subpopulací s návazností na hematologické parametry (Le, Ly) U hematologických pacientů komentář

32 MULTIPLEXY V širším slova smyslu, jakákoliv metody, kdy stanovujeme najednou (reakční prostor) více parametrů, př. „linedot“ Dnes spojeno s tzv. „microarray“ – stanovení genové exprese, proteinového profilu, ne v rutinním provozu

33 „Kuličkové“ Multiplexy Směs „kuliček“ různé velikosti a barvy potažené antigeny Detekce jakýchkoli protilátek Není zatím v rutinní praxi

34 IMUNOGLOBULINY A B- LYMFOCYTY

35 Hemopoéza

36 BCR receptor, Imunoglobuliny

37 GENETICKÁ ORGANIZACE IgH VHVH DHDH JHJH SSSSSSSSSS CC CC C 3C 3 C  1 C C  C1C1 C 2C 2 C 4C 4 CC C 2C 2 Lokalizace genu v genomu : Těžký řetězec – 14 chromozom Lehký řetězec – λ – 2 chromozom k – 22 chromozom

38 Schéma přepis IgH genu (k,l,autoreaktivita)

39 Diferenciace B-lymfocytů Diferenciace na antigenu nezávislá – v KD, změna membránové výbavy, přeskupení genu pro receptor Diferenciace na antigenu závislá – sekundární lymfatické orgány, somatická mutace (změny v genu BCR v přítomnosti antigenu, selekce klonu), izotypový přesmyk

40

41 CHARAKTERISTIKA PROTILÁTEK

42 DYNAMIKA PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI

43 ONTOGENETICKÁ DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI

44 PŘÍMÝ PRŮKAZ MIKROORGANISMU NEBO JEHO PRODUKTU kultivace mikroskopie PCR LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA INFEKČNÍCH NEMOCÍ:

45 NEPŘÍMÝ (SÉROLOGICKÝ) PRŮKAZ Stanovení protilátek obtížně kultivovatelné bakterie (lues, borelie aj.) retrospektivní nález (epidemiologie) Dynamika protilátkové odpovědi IgG x IgM

46 čas IgG IgA IgM Množství protilátek DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI

47 EBV

48 Souhrn - EBV Čeleď Herpesviridae, DNA virus Kosmopolitně Rozvojové země – v dětství, západní země – až adolescence Celoživotní nosičství (latentní infekce organismu) - perzistence v organismu, brána vstupu: buňky nosohltanu, latentní infekce lymfocytů B (transformace v permanentní buněčné linie)

49 EBV - Protilátky Neoantigeny – produkce heterofilních protilátek – Paul-Bunnell, Ericsonův test Nalezáme protilátky proti- VCA, EBNA, EA

50 Dynamika tvorby protilátek

51 Latentní fáze Latentní fáze – virová DNA se synchronně dělí s buněčnou DNA EBV – latentní proteiny – regulační fce, onkogenní potenciál

52 Lytická fáze Lytická fáze – přerušení latentní fáze a produkce infekční virionů Lytická fáze – Klidové lymfocyty se mění na proliferující buňky – transformace neboli imortalizace lymfocytů Lytická fáze – selhání složek infekce – chronická EBV infekce, nádorů asoc. S EBV, imunodeficity Lytická fáze EBV infekce – analog IL10 – inhibice makrofágů a Th1 lymfo

53 EBV - Nádory, genetika Epidemiologie a mol. Biologie – EBV se účastní řady procesů vedoucích k maligním onemocněním Gen. změny, reg. b. dělení, dif. a exp. povrch molekul, … Nazofaryngeální karcinom (jihovýchodní Asie) Burkittův lymfom Hodgkinův lymfom Dále vztav k lymfoproliferativním onemocněním spojených s vrozenou nebo získanou imunodeficiencí (X- vázaný lymfoprof. Syndrom, Wiskott-Aldrich syndrom, Ataxia teleangiectazia), (HIV)

54 Chlamydie - Charakteristika „atypickébakterie“bez buněčnéstěny z peptidoglykanu intracelulárnírůst bez vlastního energetického metabolismu => nelze je kultivovat na k. půdách, jen na tkáňových kulturách => nelze použít ATB, kterápůsobína bakteriálnístěnu (beta-laktamováATB) růstový cyklus 48-72h =>dlouhádoba léčby 2-3 týdny

55 Chlamydie - Druhy Chlamydia pneumoniae –původce bronchitid, pneumonii, sinusitid. –aterosklerózy ??? Chlamydia trachomatis původce: zánětůurogenitálního traktu, inkluzníkonjunktivitidy(s. D-K) lymfogranulomavenereum(sérotypyL1, L2, L2a,L3) trachom (serotypyA, B, Ba, C) Chlamydia psittaci –původce „papouščínemoci“ Chlamydia pecorum

56 Chlamydie - Diagnostika Ch. trachomatis – detekce z výtěru a moči, punktát – PCR Sérologie – ELISA + WB, Detekce LPS + MOMP Sérologie – neznalost dynamiky tvorby protilátek, promořenost populace, problém odlišení chronické infekce

57 Hodnocení protilátek u Chlamydií IgMIgAIgGHodnocení ---Negativní nález (falešně neg. v příliš časné fázi infekce) +--Možná počínající infekce. Vhodné opakovat vyšetření za 14 dní ++- Akutní infekce na počátku +++Probíhající infekce --+Perzist.IgG po proběhlé infekci -++-Chronická či proběhlá infekce, posuzovat dle kliniky

58 Borrelie Diagnostika především nepřímá – ELISA následná konfirmace WB Nesrovnalosti mezi výrobci

59 Děkuji za pozornost


Stáhnout ppt "Současné trendy v klinické imunologii a sérologii JAN MARTINEK."

Podobné prezentace


Reklamy Google