Současné trendy v klinické imunologii a sérologii

Prezentace na téma: "Současné trendy v klinické imunologii a sérologii"— Transkript prezentace:

1 Současné trendy v klinické imunologii a sérologii
JAN MARTINEK

2 OSNOVA Základní principy metod v imunologii a sérologii Imunoglobuliny
Problematika infekční sérologie (vybrané infekční agens)

3 Principy metod v imunologie a sérologii - DĚLENÍ METOD
Humorální Buněčné

4 Metody nefelometrie a turbidimetrie
Stanovení: proteiny akutní fáze, složky komplementu, podtřídy IgG Princip: měření intenzity světla precipitace v roztoku – přímé měření množství precipitátu - zákal kvantitativní stanovení (kalibrační křivka)

5

6 Elektroforéza Stanovení: Orientační informace o změnách v kvantitativním zastoupení jednotlivých frakcí imunoglobulínů - především Princip: Proteiny mají el. náboj podle náboje se rozdělí v elektrickém poli (albumin, , , - frakce ). možnost denzitometrické kvantifikace

7 E L E K T R O F O R É Z A

8 I M U N O F I X A C E

9 Metody – EIA Stanovení: infekční sérologie, autoprotilátky, tumor. Markery, spec. IgE … Princip: Specifická interakce mezi antigenu a protilátky s následným stanovením Typy: ELISA, FEIA, ELISPOT, CLIA, , CLIA, ECLIA, MEIA …

10 Metoda – ELISA Princip:
komplex Ag - Ab detekován sekundární protilátkou značenou enzymem (křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza) komplex Ag – Ab je vázán na imunosorbent, nenavázané Ag (Ab) se odstraní promytím vysoká citlivost (1ng/l)

11 ELISA – průkaz antigenu

12 TYPICKÝ VÝSLEDEK STANOVENÍ SPECIFICKÝCH PROTILÁTEK TECHNIKOU ELISA

13 METODA CLIA – ADVIA CENTAUR

14 Metoda – WB, Imunodot Stanovení: Infekčních, autoimunitních, spec. IgE …

15 WESTERN BLOT (IMUNOBLOT)

16 Metoda – IFA Stanovení: Především autoimunitních parametrů a dále infekční agens

17 NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE

18 Antigeny asociované s dělením buňky centriola dělící vřeténko
Autoprotilátky na HEp-2 buňkách : Antigeny asociované s dělením buňky centriola dělící vřeténko separační zóna buňky Jaderné autoantigeny polynukleotidy histony ribonukleoproteiny antigeny jadérek centroméra další antigeny Orgánově nespecifické antigeny cytoplazmy buněčné organely antigeny cytoskeletu další antigeny

19 Komplement fixace a hemaglutinace
komplement-fixační reakce je založena na vyvazování komplementu z reakčních směsí specifickými komplexy Ag s Ab – spotřeba komplementu. V druhém kroku je stanovena hemolytická aktivita komplementu (nepřítomnost protilátky se projeví lýzou). Testem jsou prokazovány směsné protilátky (nelze samostatně prokázat např. IgM). aglutinace na nosičích je precipitace převedená na aglutinaci , nejčastěji latexová aglutinace nebo pasivní hemaglutinace (HA). Všechny typy aglutinace na nosičích jsou vysoce citlivými reakcemi k důkazu protilátek.

20 NEPŘÍMÁ HEMAGLUTINACE

21 Testy Buněčné imunity Funkční testy leukocytů Stanovení počtu buněk

22 Funkční testy Fagocytosa – od metod diagnostikovaným pod mikroskopem až po aplikace na průtokovým cytometrem Fagocytosa aplikace průtoková cytometrie – využití principu, že při fagocytoze vznikají kyslíkové radikály → oxidace dihydrorodaminu na rodamin (fluorescence)

23 Funkční testy Basotest Aktivita NK buněk
Blastická transformace lymfocytů

24 Stanovení počtu Význam: především diagnostika imunodeficitů a leukemií

25 PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE vrchol současných možností analýzy
buněčných suspenzí částice jsou v laminárním proudění usměrněny do řady cytometrie určuje: - počet - velikost (FS) -„morfologii“ buněk (SS) - přítomnost fluorescenčního signálu (FL) údaje získané pro jednotlivé buňky jsou vyhodnoceny počítačem

26

27 Fluorochrom je konjugován s primární protilátkou

28 Vyjadřování výsledků - EIA metody
Index pozitivity – Cut off (referenční sérum) 0-0,9 – negativní 0,9-1,1 – hraniční >1,1 - pozitivní Kalibrační křivka – standardy

29 Vyjadřování výsledků - IFA metody
Subjektivní hodnocení, komentář Hraniční Slabě pozitivní Pozitivní Silně pozitivní

30 Vyjadřování výsledků – metody WB, Imunodot
Semikvantitativní hodnocení, komentář Subjektivní hodnocení v kombinaci se software

31 Vyjadřování výsledků – průtoková cytometrie
Procentuální vyjádření jednotlivých subpopulací s návazností na hematologické parametry (Le, Ly) U hematologických pacientů komentář

32 MULTIPLEXY V širším slova smyslu, jakákoliv metody, kdy stanovujeme najednou (reakční prostor) více parametrů, př. „linedot“ Dnes spojeno s tzv. „microarray“ – stanovení genové exprese, proteinového profilu, ne v rutinním provozu

33 „Kuličkové“ Multiplexy
Směs „kuliček“ různé velikosti a barvy potažené antigeny Detekce jakýchkoli protilátek Není zatím v rutinní praxi

34 IMUNOGLOBULINY A B-LYMFOCYTY

35 Hemopoéza

36 BCR receptor, Imunoglobuliny

37 GENETICKÁ ORGANIZACE IgH
VH DH JH S Cm C C 3 C 1 C  C1 C 2 C 4 C C 2 Lokalizace genu v genomu: Těžký řetězec – 14 chromozom Lehký řetězec – λ – 2 chromozom k – 22 chromozom

38 Schéma přepis IgH genu (k,l,autoreaktivita)

39 Diferenciace B-lymfocytů
Diferenciace na antigenu nezávislá – v KD, změna membránové výbavy, přeskupení genu pro receptor Diferenciace na antigenu závislá – sekundární lymfatické orgány, somatická mutace (změny v genu BCR v přítomnosti antigenu, selekce klonu), izotypový přesmyk

40

41 CHARAKTERISTIKA PROTILÁTEK

42 DYNAMIKA PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI

43 ONTOGENETICKÁ DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI

44 LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA
INFEKČNÍCH NEMOCÍ: PŘÍMÝ PRŮKAZ MIKROORGANISMU NEBO JEHO PRODUKTU kultivace mikroskopie PCR

45 NEPŘÍMÝ (SÉROLOGICKÝ) PRŮKAZ
Stanovení protilátek obtížně kultivovatelné bakterie (lues, borelie aj.) retrospektivní nález (epidemiologie) Dynamika protilátkové odpovědi IgG x IgM

46 DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI
čas IgG IgA IgM Množství protilátek

47 EBV

48 Souhrn - EBV Čeleď Herpesviridae, DNA virus Kosmopolitně
Rozvojové země – v dětství, západní země – až adolescence Celoživotní nosičství (latentní infekce organismu) - perzistence v organismu, brána vstupu: buňky nosohltanu, latentní infekce lymfocytů B (transformace v permanentní buněčné linie)

49 EBV - Protilátky Neoantigeny – produkce heterofilních protilátek – Paul-Bunnell, Ericsonův test Nalezáme protilátky proti- VCA, EBNA, EA

50 Dynamika tvorby protilátek

51 Latentní fáze Latentní fáze – virová DNA se synchronně dělí s buněčnou DNA EBV – latentní proteiny – regulační fce, onkogenní potenciál

52 Lytická fáze Lytická fáze – přerušení latentní fáze a produkce infekční virionů Lytická fáze – Klidové lymfocyty se mění na proliferující buňky – transformace neboli imortalizace lymfocytů Lytická fáze – selhání složek infekce – chronická EBV infekce, nádorů asoc. S EBV, imunodeficity Lytická fáze EBV infekce – analog IL10 – inhibice makrofágů a Th1 lymfo

53 EBV - Nádory, genetika Epidemiologie a mol. Biologie – EBV se účastní řady procesů vedoucích k maligním onemocněním Gen. změny, reg. b. dělení, dif. a exp. povrch molekul, … Nazofaryngeální karcinom (jihovýchodní Asie) Burkittův lymfom Hodgkinův lymfom Dále vztav k lymfoproliferativním onemocněním spojených s vrozenou nebo získanou imunodeficiencí (X- vázaný lymfoprof. Syndrom, Wiskott-Aldrich syndrom, Ataxia teleangiectazia), (HIV)

54 Chlamydie - Charakteristika
•„atypickébakterie“bez buněčnéstěny z peptidoglykanu •intracelulárnírůst •bez vlastního energetického metabolismu •=> nelze je kultivovat na k. půdách, jen na tkáňových kulturách •=> nelze použít ATB, kterápůsobína bakteriálnístěnu (beta-laktamováATB) •růstový cyklus 48-72h =>dlouhádoba léčby 2-3 týdny

55 Chlamydie - Druhy •Chlamydia pneumoniae
–původce bronchitid, pneumonii, sinusitid. –aterosklerózy ??? •Chlamydia trachomatis •původce: zánětůurogenitálního traktu, inkluzníkonjunktivitidy(s. D-K) •lymfogranulomavenereum(sérotypyL1, L2, L2a,L3) •trachom (serotypyA, B, Ba, C) •Chlamydia psittaci –původce „papouščínemoci“ •Chlamydia pecorum

56 Chlamydie - Diagnostika
Ch. trachomatis – detekce z výtěru a moči, punktát – PCR Sérologie – ELISA + WB, Detekce LPS + MOMP Sérologie – neznalost dynamiky tvorby protilátek, promořenost populace, problém odlišení chronické infekce

57 Hodnocení protilátek u Chlamydií
IgM IgA IgG Hodnocení - Negativní nález (falešně neg. v příliš časné fázi infekce) + Možná počínající infekce. Vhodné opakovat vyšetření za 14 dní +- Akutní infekce na počátku Probíhající infekce Perzist.IgG po proběhlé infekci Chronická či proběhlá infekce, posuzovat dle kliniky

58 Borrelie Diagnostika především nepřímá – ELISA následná konfirmace WB
Nesrovnalosti mezi výrobci

59 Děkuji za pozornost