2013 Marek Vácha Kmenové buňky.

Prezentace na téma: "2013 Marek Vácha Kmenové buňky."— Transkript prezentace:

1 2013 Marek Vácha Kmenové buňky

2 Kmenové buňky mají tři charakteristické rysy:
1. jsou nediferencované 2. v tomto nediferencovaném stavu se mohou dlouhou dobu rozmnožovat 3. za jistých podmínek mohou dávat vznik specializovaným buňkám, jako jsou nervové buňky, svalové buňky, buňky produkující insulin, atd. (známo přes 200 buněčných typů v lidském těle)

3 Kmenová buňka 1. Není terminálně diferencovaná (není tedy na konci cesty vedoucí k diferenciaci) 2. Může se dělit bez jakéhokoli limitu (nebo přinejmenším do smrti zvířete) 3. Když se rozdělí, každá z dceřinných buněk má volbu: buď může zůstat kmenovou buňkou, nebo nastoupí cestu vedoucí k terminální diferenciaci) (Alberts, B., Jonnson, A., Lewis, J., et al. (2002) Molecular Biology of The Cell. 4th ed. Garland Science. New York.)

4 Obraz vytvořený Conradem Waddingtonem představuje epigenetickou krajinu. Cesta kuličky znázorňuje různé osudy buněk. C.H. Waddington: Organisers & genes. Cambridge University Press, 1940

5 embryonální kmenové buňky

6 Kmenové buňky byly poprvé isolovány z myší v roce 1981.
Embryonální kmenové buňky člověka byly poprvé isolovány v roce 1998 Dr. James Thomson, Wisconsin university financováno z Geron corporation). Dr. John Gearhart of Johns Hopkins University James A. Thomson říká že přemýšlel "dlouho a usilovně" než přistoupil k výzkumu na embryonálních kmenových buňkách

7 Thomson a Gearhart použili odlišné metodiky, avšak oběma se zdařilo isolovat velmi rané prekursorové buňky a aplikovali je na vrstvu myších feeder buněk, čímžto získali kulturu nesmrtelných lidských pluripotentních kmenových buněk. James Thomson (vlevo) a John Gearhart (vpravo)

8 James A. Thomson (2007) ...jeho laboratoř je jednou ze dvou na světě, která zvládla proces přeměny buněk kůže na kmenové buňky s parametry velmi podobnými, jaké mají embryonální kmenové buňky. Pravda je, řekl Dr. Thomson v rozhovoru, že měl etické obavy z výzkumu na embryích od počátku, navzdory jistotě, že takovýto výzkum vnese nové světlo do vývoje člověka a má v sobě potenciál pro nové léčby nemocí. "Pokud vám z výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách není alespoň trochu nevolno, pak jste o něm ještě dostatečně nepřemýšleli." “If human embryonic stem cell research does not make you at least a little bit uncomfortable, you have not thought about it enough,” “Přemýšlel jsem dlouho a usilovně o tom, zda bych měl do výzkumu jít." (New York Times, )

9 Embryonální kmenové buňky

10 Embryonální kmenové buňky
Embryonální kmenové buňky, které se budou v kultuře rozmnožovat 6 nebo více měsíců aniž by se diferencovaly, které si zachovaly schopnost pluripotence a zdají se býti geneticky normální jsou považovány za linii embryonálních kmenových buněk

11 iPSCs - Indukované pluripotentní buňky

12 2012: Shinya Yamanaka získává Nobelovu cenu
Shinya Yamanaka a John Gurdon

13 Shinya Yamanaka původním vzděláním lékař, nejprve klinik, pak ortopedický chirurg cíl: nalézt cestu, jak diferencovaných buněk vytvořit pluripotentní kmenové buňky. Yamanaka začal se seznamem 24 genů, které se zdály důležité u embryonálních kmenových buněk

14 Yamanaka se rozhodl testovat nejrůznější kombinace těchto genů s (velmi malou) nadějí, že se zdaří najít sestavu, která diferencovanou buňku přemění v pluripotentní základní výzkum na myších s použitím genu neoR pro rezistenci k neomycinu. Gen se exprimoval pouze u pluripotentních buněk Oct4, Sox2,Klf4,c-Myc savčí buňka obsahuje kolem genů a je neuvěřitelné, že pouhé čtyři z nich přemění plně diferencovanou buňku v pluripotentní.

15 Shinya Yamanaka a jeho postdoc Kazutoshi Takahashi

16 2012: Shinya Yamanaka získává Nobelovu cenu
„Zasluhuje si nejen Nobelovu cenu za medicínu, nýbrž rovněž Nobelovu cenu za etiku.“ (Julian Savulescu, Uehiro Chair in Practical Ethics & Director, Oxford Uehiro Centre for Practical Ethics) “Je to vzácný příklad vědeckého objevu, který může vyřešit víc etických problémů než vytvoří.“ Mnoho etických námitek vůči výzkumu na kmenových buňkách se soustředilo na fakt, že zde dochází k destrukci lidských embryí. iPS cell technologie vědcům umožňuje obejít tyto námitky tím, že vytvoří oluriopotentní kmenové buňky z tkání dospělého člověka. Ovšem pro tuto chvíli se domnívám, že výzkum na iPS buňkách musí běžet paralelně s výzkumem na embryonálních kmenových buňkách.“ (Dr Tom Douglas, Wellcome Trust Research Fellow Oxford Uehiro Centre for Practical Ethics University of Oxford)

17

18 iPSC = indukované pluripotentní kmenové buňky
přidáním pouhých 4 genů do buněk lidské kůže byli výzkumníci schopni přeprogramovat tyto buňky zpět do stavu podobnému stavu raného embrya. Shinya Yamanaka buňky mají schopnost se vyvinout do jakéhokoli buněčného typu těla člověka

19 iPS iPS tak možná poslouží jako zdroj imunologicky kompatibilních buněk použitelných pro pacienty, trpící v tuctu chvíli těžko léčitelnými chorobami jako je např. Alzheimerova choroba, aniž by nastal jakýkoli etický problém spojený s využíváním embryonálním kmenových buněk nebo cybridů.

20 iPS cells: potenciální využití
pacienti, trpící nějakou nemocí, mohou poskytnout své vlastní buňky, které následně budou repreogramovány do iPS buněk, které mohou sloužit jako modelové buňky pro porozumění dané chorobě a případné terapii pacientovy vlastní buňky mohou být reprogramovány do iPS a pak použity jakožto náhrada nefunkčních tkání linie lidských iPS buněk již existují od pacientů trpících nemocemi jako je diabetes prvního typu, Parkinsonova choroba a tucet dalších

21 tato technologie již byla úspěšně použita u myší trpících srpkovitou anémií (tyto myši byly pomocí technik genového inženýrství upraveny, aby touto nemocí trpěly)

22 díky výzkumu několika laboratoří se ovšem v současnosti ukazuje, že existují přece jen rozdíly mezi iPS a ES buňkami, zejména co se týče genové exprese a dalších buněčných funkcích, jako je buněčné dělení. přinejmenším do té doby, dokud tyto rozdíly nebudou plně pochopeny bude zřejmě pokračovat výzkum na ES buňkách (a pravděpodobně i po té) (Reece, J.B., Urry, L.A., (2011) Campbell Biology. 9th. ed. Pearson Publication, Inc. , New York. p. 462)

23 Klasifikace (ESC)Human embryonic stem cells, které se dají získat z lidského embrya ve stadiu blastocysty (4-5 den po oplození) 5. den obsahuje blastocysta asi 100 buněk, ICM tvoří 30 z nich (FSC)Human embryonic germ cells, které mohou být izolovány z primordiálních zárodečných buněk (primordial germ cells) plodu. Získávají se z plodu ve stáří 5 – 10 týdnů. Jedná se o buňky, ze kterých by se normálně vyvinuly gamety. U spontánních abortů není etický problém. U vyprovokovaných potratů je: nebezpečí dělání potratů jen proto. (ASC)Human somatic stem cells, které mohou být izolovány z dospělého člověka nebo z tkání plodu nebo z krve pupeční šňůry. V těle člověka je asi 20 druhů těchto kmenových buněk (nervové, hematopoietické atd.)

24

25 Druhy kmenových buněk podle schopnosti diferenciace
Progenitorové kmenové buňky – nakonec z nich vznikne pouze jediný buněčný typ. Např. epidermální kmenové buňky dají vznik keratinocytům a spermatogoniální kmenové buňky dají vznik spermiím Multipotentní kmenové buňky – dají vznik několika buněčným typům, ze kterých může vzniknout tkáň nebo orgán. Příkladem jsou kmenové buňky kůže, ze kterých vzniknou epidermální buňky, mazové žlázy a vlasové folikuly. Z hematopoietických kmenových buněk různé typy krvinek (erytrocyty, lymfocyty atd.) Z neurálních kmenových buněk vzniknou všechny buněčné typy nervového systému (gliové buňky a mnoho typů neuronů)

26 Embryonální kmenové buňky

27 Multipotentní kmenové buňky

28 Druhy kmenových buněk podle schopnosti diferenciace
Pluripotentní kmenové buňky – jsou schopny dát vznik všem odlišným buněčným typům in vitro. Nemohou ale dát vznik embryu. Mohou být izolovány buď z germ cells plodu, pak hovoříme o EG cells, nebo z ICM, pak se jedná o ES cells. Nevyskytují se přirozeně v těle, což je odlišuje od progenitorových buněk a multipotentních buněk Totipotentní kmenové buňky – u člověka jen zygota a snad první blastomery (2,4,8?)

29 pluripotentní (literárně) = "schopná dělat mnoho mnoho věcí "

30 každá z blastomer (2,4,8 buněk raného embrya) je považována za buňku schopnou vytvořit celé nové embryo, včetně trophoblastu isolované ICM buňky pravděpodobně již nejsou schopny trophoblast vytvořit

31 Embryonální kmenové buňky

32 Možné zdroje lidských embryonálních kmenových buněk
Nadbytečná embrya. Jedná se o embrya vytvořená pro potřeby IVF a následně nepoužitá. V zemích kde je povolena preimplantační diagnostika se může jednat o kmenové buňky z embryí, které byly zavrženy v souvislosti s PID. Všechny tyto embrya mohou být použita k výzkumným účelům, dají–li rodiče informovaný souhlas. Odstraní se trofoblast a buňky ICM jsou vloženy na vrstvu myších fibroblastů Embrya vytvořená metodou IVF pro výzkumné účely a pro účely obstarání embryonálních kmenových buněk. Jsou tedy vytvořeny splynutím lidské spermie a lidského vajíčka.

33

34 Možné zdroje lidských embryonálních kmenových buněk
Embrya vytvořená metodou SCNT pro výzkumné účely nebo pro účely obstarání embryonálních kmenových buněk. Je to výhodné proto, že při tomto terapeutickém klonování bychom se vyhnuli problému s imunitní odpovědí organismu. Další možnosti. Možná by se daly rovněž získat kmenové buňky injekcí cytoplazmy z lidského vajíčka či lidské kmenové buňky do nějaké diferencované buňky lidského těla. (ovoplasmický transfer). Eventuelně by šlo přeprogramovat i normální somatické buňky, aby se začaly chovat jako stem cells.

35 Možné zdroje lidských somatických kmenových buněk
Tkáně a orgány dospělého člověka. Kmenové buňky kostní dřeně se dají získat invasívní intervencí, např. procedurou spojenou s darováním kostní dřeně. Rovněž bylo publikováno obdržení kmenových buněk po autopsii, z post mortem  mozkové tkáně Tkáně a orgány plodu – tkáně a orgány získané z plodů po ukončení těhotenství, zejména neurální kmenové buňky z mozkové tkáně. Asi 400 pacientů ve Švédsku a USA léčeno proti Parkinsonově chorobě. Do každé hemisféry dostali tkáň ze 6 – 8 plodů

36 Možné zdroje lidských somatických kmenových buněk
Krev z pupečníkové krve – hematopoietické kmenové buňky mohou být obdrženy z krve pupeční šňůry při porodu. V této krvi mohou být rovněž i další kmenové buňky. Je zde ovšem jen malé množtví buněk. cena – Kč buněk je tak málo, že se dají použít jen pro děti do cca 5 let max. dítě nesmí mít akutní leukémii a samozřejmě žádnou jinou, např. genetickou chorobu (kterou mají pochopitelně i SC) mohlo by to fungovat max. pro pevné nádory u dítěte do stáří cca 2 roky – to ale skoro nikdy nemá

37 Využití kmenových buněk
terapeutické koncepty ve farmakologii a toxikologii genové terapie (v případě leukémií, pokud bychom do SC vložili vhodný gen) porozumění ontogenetického vývoje člověka porozumění základním mechanismům diferenciace a proliferace

38 Výhody a omezení lidské embryonální kmenové buňky
jsou pluripotentní hES cells jsou zatím jediné kmenové buňky které se dají snadno získat a pěstovat v dostatečné množství

39 Výhody a omezení lidské embryonální kmenové buňky
největší problém je v imunitní odpovědi. Protože nemohou být získány přímo z pacienta, je zde vždy risk imunologické odpovědi. protože mají tak velký potenciál, bude zřejmě obtížné je uhlídat, aby se nediferencovaly v nežádoucí typ tkáně, eventuálně aby z nich nevznikl tumor. současné metody umožňují pěstování těchto buněk pro výzkumné účely, avšak pokud jsou jako feeder buňky použity myší fibrocyty, je vyloučeno používat za těchto podmínek lidské ES buňky k transplantacím

40 Výhody a omezení lidské somatické kmenové buňky
potenciál je mnohem větší než se myslilo mohou se užít pacientovy vlastní kmenové buňky a tím bychom se vyhnuli problému imunitní odpovědi. v budoucnosti bychom mohli léčivy povzbudit pacientovy vlastní kmenové buňky přímo in situ.

41 Výhody a omezení lidské somatické kmenové buňky
isolace, růst a diferenciace je stále komplikovanější než u embryonálních. pokud trpí pacient genetickou chorobou či sklony k rakovině, to vše se přenese i do kmenových buněk, což omezuje jejich možnosti v léčení např. diabetu. dospělé kmenové buňky již mohou mít poškozenou DNA díky slunečnímu záření, toxinům a chyb při replikaci

42 Příklady terapií, u kterých v současnosti probíhá intenzivní výzkum
Neurologické nemoci (Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba) poranění míchy roztroušená skleróza selhání srdce diabetes popáleniny různé typy rakoviny (např. leukémie) svalová dystrofie

43 další poznámky

44 Kmenové buňky napodobují lidský mozek „The big surprise was that it worked“
Tento kapkovitý útvar vyrost natolik, že začal připomínat mozek foetu v devátém týdnu vývoje. buňky jsou odvozeny z buněk kůže shluk nervových buněk velikosti hrášku by se mohl ukázat důležitým při výzkumu lidských neurologických onemocnění. tato kulička buněk ovšem postrádá kapiláry, což může být důvodem, proč má jen 3-4 milimetry v průměru, i když roste 10 měsíců či více. srpen 2013

45 Dr. Woo Suk Hwang 24. listopadu 2005 Dr. Hwang resignuje, neboť je mu prokázáno, že za některé oocyty bylo placeno některé oocyty byly brány od jeho postgraduálních studentek dvě ze tří prací v Science byly podvodné 2012: Dr. Hwang hodlá naklonovat mamuta V srpnu 2005 byl naklonován pes

46 V roce 2001, výzkumná skupina v Massachusetts získala touto technikou několik prvních buněčných dělení v tomto typu experimentu O několik let později, výzkumná skupina ze Soulu v Jižní Korei publikovala vytvoření klonovaných lidských embryí až do stadia blastocysty... ...avšak tito vědci byly později shledáni vinnými z podvodu a vymýšlení dat

47 Cybridi ve Velké Británii byly registrovány (2007) žádosti tří výzkumných týmů pro licencování použití králičích, kravích a kozích oocytů za účelem vytvoření embryí cytoplazmatických hybridů, tzv. cybridů. návrh, podporován komunitou výzkumníků, vyústil ve fakt, že HFEA dala "v principu souhlas" s použitím této technologie (2007)

48 Cybrids

49 legislativa

50 historie - USA

51 Historie - USA 1975: The National Commission for the Protection of Human Subjects of Biomedical and Behavioral Research vydala zprávu doporučení týkající se práce s lidskými foety žádné federální peníze nebudou užity při IVF lidských oocytů dokud speciální Ethics Advisory Board nezváží všechny etické dopady 1994: NIH založilo the Human Embryo Research Panel některé oblasti výzkumu na lidských embryích by mohly být placeny z federálních peněz, včetně výzkumu na embryích vytvořených toliko za účely výzkumu ovšem president Clinton nařídil NIH nealokovat finanční zdroje na "podporu vytváření lidských embryí za účely výzkumu" na druhou stranu toto nařízení neříkalo nic o výzkumu na nadpočetných embryích

52 Historie - USA 1994 Kongres zastavil veškeré podnikání s embryi souhrnným zákonem, který zakázal NIH používat federální peníze pro jakýkoliv (any and all) výzkum na lidských embryích 1998 právníci NIH zastávají názor, že tento zákon vlastně nezakazuje používání federálních peněz na výzkum na již existujících liniích embryonálních kmenových buněk, za podmínky, že výzkumníci sami nejsou odpovědni za destrukci embryí, která je ovšem nutná pro získání těchto linií.

53 Historie - USA 2000 poté, co studie National Bioethics Advisory Commission podporovala takovýto typ výzkumu a poté, co NIH vytvořila pravidla, president Clinton autorizoval financování tohoto výzkumu z federálních peněz. srpen 2000: vědci mohou žádat federální peníze pouze pro výzkum užívající 78 již existujících linií embryonálních kmenových buněk. reálný počet linií, které byly vhodné a k dispozici byl kolem dvaceti (21). Kass, L.R., (2002) Life, Liberty and the Defense of Dignity. Encounter Books, New York, London. p

54 Historie - USA srpen 2001 federální vláda souhlasí s finanční podporou výzkumu na embryonálních kmenových buňkách, ovšem pouze na již existujících liniích embryonálních kmenových buněk a za podmínky, že nedojde k žádné další destrukci lidských embryí. President Bush souhlasil s financováním výzkumu na embryonálních kmenových buňkách, ovšem omezil federální peníze pouze na podporu 21 linií existujících v roce

55 Historie - USA restrikce se ovšem netýká privátních peněz, pouze federálních! 09/03/2009 prezident Obama uvolňuje státní fondy 23/08/2010 federální soud blokuje rozhodnutí prezidenta Obamy z roku s odůvodněním, že toto rozhodnutí porušuje zákaz používání federálních peněz k destrukci lidských embryí..

56

57 USA 23/08/2010 když se kauza znovu dostala k projednání, soudce Lamberth seznal, že stávající politika jasně porušuje Dickey-Wicker Amendment, zákon, který prošel kongresem a který říká, že žádné federální peníze nebudou použity na "výzkum, při kterém lidské embryo nebo embrya budou zničeny, rozebrány nebo záměrně uvedeny do rizika zranění či smrti." (“research in which a human embryo or embryos are destroyed, discarded or knowingly subjected to risk of injury or death.”) Obamova administrativa kontrovala prohlášením, že stávající politika neporušuje Dickey-Wicker Amendment, neboť federální peníze jsou užity pouze na již vytvořených liniích kmenových buněk a že nebudou užity v procesu, při kterém jsou embrya zničena. soudce oponoval konstatováním, že "výzkum na liniích embryonálních kmenových buněk nezbytně závisí na destrukci lidských embryí."

58 USA 29/04/2011 odvolací soud konstatoval, že vzhledem k tomu, že zákon je psán v přítomném čase, se nevztahuje na minulé činy. (“it does not extend to past actions.”) Soudkyně Karen LeCraft Henderson, která s tímto rozhodnutím nesouhlasí, napsala, že její kolegové provádějí "lingvistické jujitsu” aby dospěli ke kýženému závěru. jasný jazyk zákona zakazuje financování jakéhokoli výzkumu, který následuje destrukci lidských embryí a je bezesmyslné snažit se od sebe oddělit proces destrukce od užití linií kmenových buněk, který z tohoto procesu vychází.

59 Evropa

60 Lze na embryích provádět pokusy?
Konvence Rady Evropy o ochraně lidských práv a důstojnosti lidské bytosti ve vztahu k využití biologie a medicíny ( Oviedo 1997) čl. 18 1. Pokud zákon dovoluje výzkum na embryích in vitro, musí zajistit odpovídající ochranu embrya Pokud se pokus dělá, embryo zanikne. Jedinou výjimkou by bylo pěstovat embryo až do viability, což je ještě horší 2. Vytváření lidských embryí pro pokusné účely je zakázáno

61 Regulace výzkumu na hES cells v EU
Členské státy zaujímají výrazně odlišné pozice a nové zákony a návrhy zákonů jsou stále projednávány

62 Regulace výzkumu na hES cells v EU
Německo: Zákaz pořizování hES cells z nadbytečných embryí, avšak zákonem je povolen dovoz a používání linií, pokud byly vytvořeny před 1. lednem 2002 22. května 2008 byl tento dovoz a používání posunut na 1. květen 2007

63 Situace ve světě Irsko: zákaz výzkumu na embryích (nenarozené dítě má stejná práva jako matka) Itálie zakazuje tvorbu nebo splitting embryí pro terapeutické nebo výzkumné účely. Japonsko sice zakazuje reprodukční klonování, ale povoluje výzkum na nadbytečných embryích Holandsko, Kanada, Švédsko, Finsko a Španělsko povolují výzkum na nadpočetných embryích, pokud tato ale nejsou starší než 14 dní

64 Regulace výzkumu na hES cells v EU
Velká Británie: Je zákonem povoleno obstarávání hES cells z nadbytečných embryí povoleno vytváření lidských embryí za účelem výzkumu zákonem z r povoleno terapeutické klonování

65 Regulace výzkumu na hES cells v EU
Švýcarsko: na podzim 2004 celonárodní referendum 66 % procent se vyjádřilo pro výzkum – jedná se o 7 dní stará embrya referendu předcházela tříměsíční kampaň ze strany státy pro podporu výzkumu referendum vyprovokovala strana zelených a hnutí pro-life

66 Regulace výzkumu na hES cells v EU
Česká republika: zákon 227/2006 z 26. dubna 2006

67 227/2006 Česká republika Výzkum na lidských embryonálních kmenových buňkách lze provádět pouze na základě povolení, které vydá Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy (dále jen "ministerstvo"). Tento výzkum může být prováděn pouze na pracovištích, která jsou uvedena v povolení k výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách.

68 227/2006 Česká republika (2) Výzkum na lidských embryonálních kmenových buňkách lze provádět pouze a)na dovezených liniích, pokud byly získány z lidských embryí způsobem, který neodporuje právním předpisům České republiky a země původu, jejich dovoz byl povolen ministerstvem a jediným důvodem dovozu do České republiky je jejich využití pro výzkumné účely podle tohoto zákona, nebo b)na liniích získaných z nadbytečných lidských embryí ve zdravotnických zařízeních v České republice, ve kterých se provádí asistovaná reprodukce podle zvláštního právního předpisu1) (dále jen "centrum asistované reprodukce").

69 Zákon 373/2011 platný od 1. dubna 2012 Zákon č. 373/2011 Sb., o specifických zdravotních službách §3 (5) Zárodečné buňky a lidská embrya mohou být použita pouze pro umělé oplodnění. To neplatí, jde-li o lidská embrya nevyužitá pro umělé oplodnění, která lze použít pro výzkum na lidských kmenových embryonálních buňkách za podmínek a pro účely stanovené zákonem upravujícím výzkum na lidských kmenových embryonálních buňkách3).

70 VIZ seminář „Status lidského embrya“ na vyuka.lf3.cuni.cz
etika

71 Diskuse Pokud se kmenové buňky berou z embryí, debata se ocitá na v podstatě stejném území jako diskuse o potratech

72 SCNT "Terapeutické klonování"
Pro Proti Embryo nevzniklo „přirozeně“ (fúzí spermie a oocytu), a nikdo jej nezamýšlí implantovat do dělohy celý útvar – uprázdněný oocyt + vložené jádro somatické buňky vůbec nemusíme nazývat embryem V budoucnu se nám snad podaří signály z oocytu napodobit a použijeme pouze buňku kůže a obejdeme se bez oocytu… … nastal by pak nějaký problém? Je jedno, jak embryo vzniklo, jakmile je to již embryo, má stejný morální status bez ohledu na okolnosti vzniku každé klonování je reprodukční argument kluzkého svahu, „slippery slope“: pokud povolíme terapeutické klonování, je těžko představitelné, že někdo nezkusí naklonovaná embrya použít por reprodukční klonování

73 Many Thanks for your kind attention
Marek Vácha