Mutace vedoucí k farmakogenetickým chorobám Příklad: maligní hypertermie

Farmakogenetika speciální oblast biochemické genetiky, která pojednává o variabilitě odpovědi na léky (..ale i jiné chem. látky) způsobené genetickou variabilitou genetická variabilita, která mění schopnost organismu absorbovat, transportovat, metabolizovat či vylučovat léky (chem. látky) nebo jejich metabolity polymorfizmus pro lékovou odpověď (6,7 % - nežádoucí reakce na léky)

Maligní hypertermie AD porucha, u které se může vyskytnout dramatická nežádoucí reakce na aplikaci všech běžně používaných inhalačních anestetik (např. halothanu) a myorelaxancií vznik vysoké horečky, přetrvávající svalová kontrakce, vystupňovaný katabolismus příčina smrti při anestézii (zejména u dětí) – mortalita 10 – 20 % incidence 1 : 15 000 u dětí 1 : 50 000 u dospělých

Svalová buňka dějiště primární abnormality při MH MH – porucha kalciového metabolismu příčně pruhovaného svalstva !!! stoupající a klesající množství kalcia způsobuje svalové kontrakce a relaxace rozhodující význam pro homeostázu kalcia - ryanodinový receptor - kalciový releasing kanál na sarkoplasmatickém retikulu kontrakce svalu uvolnění Ca2+ do myoplasmy relaxace svalu resorbce Ca2+ do ER ATPdependentní

Snímek z elektronového mikroskopu zachycující spojení endoplasmatického retikula a T-tubulu ukazuje polohu ryanodinového receptoru RYR1

Podstata onemocnění MH Za hlavní příčinu je považována porucha funkce ryanodinového receptoru RYR1 sval se změněnou funkcí RYR1 vnímavý sval při kontaktu s triggersubstancí vzniká nekontrolované uvolňování Ca2+ ze SR s poruchou jeho zpětného vychytávání Konfokálně nasnímaný obraz nahromadění Ca2+ (zelená a žlutá barva) v cytosolu svalové buňky za 1s (bílá čára) během jednoho akčního potenciálu. R. Corado

„Triggersubstance“ (spouštěče) - substance vyvolávající u MHS pacientů rozvoj MH - krize Látky běžně užívané k úvodu a vedení celkové anestezie: volatilní čili prchavá anestetika - všechny halogenové uhlovodíky jako halotan, isofluran, desfluran, sevofluran depolarizující svalová relaxancia - zejména sukcinylcholin

MH episoda Triggersubstance volatilní anestetika depolarizující svalová relaxancia MHS (MH susceptible) pacient

Vlna depolarizace z nervosvalové ploténky vyvolá drobný únik Ca2+ z TT Kontakt vnímavého svalu (tj. se změněnou funkcí RYR1) s triggersubstancí Vlna depolarizace z nervosvalové ploténky vyvolá drobný únik Ca2+ z TT Indikuje masivní a nekontrolované uvolňování Ca2+ ze SR spojené s poruchou jeho zpětného vychytávání Zvýšená intacelulární koncetrace Ca2+ Zvýrazněná a dlouhotrvající interakce kontraktilních proteinů svalového vlákna aktinu a myozinu bez následné relaxace

extrémní nároky na kyslík Nastává protahovaná svalová kontrakce Dramatický vzrůst aerobního, později anaerobního metabolismu extrémní nároky na kyslík nadprodukce CO2 nadprodukce tepla zvýšená teplota svalu znamená nižší potřebu Ca2+ pro reakci aktinu a myosinu toxická koncentrace Ca2+ brzdí oxidativní fosforylaci v mitochondriích tzn. tvorbu ATP potřebnou pro resorpci Ca2+

Kauzální terapie MH Dantrolen Schválen 1979 působí na úrovni dyhydropyrimidinového receptoru pravděpodobně zde blokuje přenos membránového potenciálu tlumí tak uvolňování Ca2+ ze SR neovlivňuje zpětné vstřebávání Ca2+ Jeho zavedení přispělo ke snížení mortality při MH – krizi ze 70-80 % (konec 70.let) na 5-10%.

Molekulárně genetická Diagnostika MH In vitro kontrakční test Molekulárně genetická diagnostika

Diagnostika MH In vitro kontrakční test vzorek svalové tkáně získané otevřenou biopsií vystaven působení klasických spouštěčů halotanu a kofeinu ve stoupajících koncetracích měřena velikost kontrakce svalového vlákna sval s dispozicí k MH se kontrahuje zřetelně více a při nižších koncentracích než zdravý sval specifita 94%

Molekulárně genetická diagnostika – mutační analýza genu RYR1 Diagnostika MH Molekulárně genetická diagnostika – mutační analýza genu RYR1 Komplikace: diskordance mezi MH susceptibilitou and RYR1 mutacemi potřeba nezávislého biochemického důkazu, že kandidátní MH mutace je patogenní nízká incidence každé RYR1 mutace rozsáhlost RYR1 genu

- lokalizace: 19q12.1-13.2 - 106 exonů - cDNA 15 301bp RYR1 gen Exprese RYR1 genu v lidských tkáních

RYR1 gen a protein, lokalizace MH mutací 2 11 12 14 3´ 6 15 17 39 46 45 40 102 106 EXONS RYR1 gene A2350T G2434R R2435H R2435L COOH NH2 Myoplasmatic RYR1 domain Transmembrane / lumenal RYR1 domain RYR1 protein C35R T2206M T2206R R2452W R2454C R2454H R2458C R2458H R2163C R2163PR2163H V2168M R614C R614L R163 G248R I403M R471C Y522S R533H R552W L4793P Y4796C R4825C T4826I R4861H G4891R G341R MH/CCD region 1 MH/CCD region 2 MH/CCD region 3 R4893W I4898T G4899R G4899Q A4906V R4914G 5´

Mutace v RYR1 genu více než 50% MH rodin a většina CCD rodin detekováno 45 mutací - 41nukleotidových substitucí - 4 malé delece jsou nahromaděny ve třech regionech genu RYR1 : MH/CCD region 1 : N-terminalní AK 35 -614 MH/CCD region 2 : centrálně lokalizované AK 2163 - 2548 MH/CCD region 3 : C-terminální 100 4800 4900 5000 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 200 300 500 400 600 nucleotide substitions ( missense / nonsense ) small deletions RYR1 amino acid sequence

Strategie v mutační analýze RYR1 genu (dr. I. Valášková, OLF FN Brno) - zaměřili jsme se na dva regiony s největším výskytem mutací N-terminalní region centrálně lokalizovaný region Je prováděna PCR amplifikace exonů 6, 11, 12, 17, 39, 40, 45,46 PCR fragmenty jsou přímo sekvenovány na ABI PRISM 310.

PCR produkty analyzovaných exonů RYR1 genu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Exons: 6 11 12 17 39 40 45 46 M PCR produkty analyzovaných exonů RYR1 genu 5% PAG dráha 1 - 8: exony RYR 1 genu dráha 9: molecular weight marker pBR322/AluI

Single nucleotide polymorphism (H2420H) u dětského MH patcienta C>T Single nucleotide polymorphism (H2420H) u dětského MH patcienta CT transice ve třetí kodonové pozici ( CAC - CAT ) nemění AK histidin , který je kodován kodonem 2420 .

Kdy je nalezená mutace kauzální ? nutný nález alespoň 2 rodokmenů (nepříbuzných MH vnímavých rodin) s danou mutací, mutace musí být potvrzena u více než 1 člena dané rodiny negativní nález u 100 MHN jedinců pokrevně nepříbuzných (vyloučení polymorfizmu)

Nová strategie mutační analýzy RYR1 genu Použit screening RYR1 cDNA pro maximalizaci efektivity identifikace RYR1 mutací. Metoda: total RNA izolovaná z periferní krve cDNA syntéza PCR amplifikace částečně se překrývajících RYR1 cDNA segmentů, representují hot spot regiony RYR1 genu sekvenace 600-700bp dlouhých PCR productů

Strategie mutační analýzy RYR1 genu RYR1 cDNA sekvence/ distriduce RYR1 mutací nucleotide substitions ( missense / nonsense ) small deletions 300 14400 14700 15000 5400 5700 6000 6300 6600 6900 7200 7500 600 900 1500 1200 1800 RNA RT cDNA PCR 1 3 2 5 7 9 4 6 8 1 - 9 cDNA fragmenty délky 600 -700bp sekvenování

Electroforeza PCR produktů 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 700bp 600bp Electroforeza PCR produktů RYR1 cDNA segmentů 1-9 5% PAG, silver stained weight marker 100 bp DNA Ladder Chromatogram cDNA segment 9 (670 bp)

Národní centrum pro diagnostiku MH (NCDMH) v Brně ARO FN Brno ARK USA OLG FN Brno vyhledávaání a databáze rizikových rodin (99 k 15.6. 2004) diagnostika MH

Tromboembolická nemoc a genetické rizikové faktory

Tromboembolická nemoc (trombofilie) vrozená či získaná porucha hemostatického mechanismu – příčina vzniku trombóz (venózní či arteriální) patří mezi nejčastější příčiny úmrtí incidence 1 – 5 případů /1000 osob ročně

Klinické symptomy vznik žilní trombozy do 45 let, arteriární do 35 let opakované či atypické trombózy hypertenze v těhotenství infarkt placenty - potraty

Žilní tromboembolismus Vnější faktory kouření úrazy chirurgický zákrok hormonální antikoncepce obezita imobilizace Vrozená predispozice Leidenská mutace (mutace v genu koagulačního faktoru V) mutace v genu pro protrombin (faktor II)

Koagulace krve koagulace –fyziologický mechanismus chránící organizmus před ztrátou krve komplexní mechanismus kontrolovaný různými skupinami plazmaproteinů proces vyžadující jemnou rovnováhu mezi koagulačními a antikoagulačními faktory zpětnovazebný systém

Gen pro faktor V Genetická mapa: 1q23 Leidenská mutace: Exon 10 Bodová mutace G1691A, AD typ dědičnosti Substituce Arg506(CGA) to Gln(CAA) Faktor V (proakcelerin) – plazmatický protein 2196 AMK – prekurzor kofaktoru Va – syntéza trombinu – koagulace mutovaný faktor Va není správně inaktivován proteinem C (tzv. APC rezistence) !!!

Funkce faktoru V v procesu krevního srážení Proces krevního srážení A) fyziologický proces B) patologický proces faktor V faktor V trombin trombin propeptid propeptid + + faktor Va faktor Va s mutací (G1691A) APC APC inaktivní faktor V aktivní faktor V tromby tromby

Přehled výskytu Leidenské mutace v některých populacích Řecko 13% Švédsko 11% Francie 10% V. Británie 9% Německo 9% Holandsko 5% Polsko 5% ČR – 5,7 % !!! Argentina 5,1% Venezuela 2,4% Costa Rica 2% Indie 1,3% Čína vzácně Čenošská populace nedetekováno Japonsko nedetekováno

Riziko trombózy u nosičů 1691A mutace riziko vzniku trombózy u nosičů mutantní alely se zvyšuje oproti normálnímu genotypu 5 – 10x u heterozygotů a 50 – 100x u homozygotů u nosičů mutací jsou trombotické epizody často vyvolány: těhotenstvím, užíváním horm. antikoncepce, traumatem, chir. zákrokem, kouřením riziko trombózy při užívání horm. antikoncepce je u heterozygotů 28 – 35 x vyšší !!!

Mutace v genu pro protrombin substituce G na A (G20210A) frekvence v ČR 2,3 % u nosičů mutantní alely stoupá riziko trombózy 2 – 6 x Pokud je žena nosičkou mutantní alely faktoru V, zároveň nese mutaci pro protrombin a užívá hormonální antikoncepci – riziko trombózy je 149x vyšší !!! Interakce dvou mutantních alel a jednoho vnějšího faktoru !!!

Metody pro detekci LM RFLP - restrikční enzym MnlI SSCP detekční kit „Factor V Gene Mutation Assay“ Real Time PCR (LightCycler)

Stanovení přenašečů Leidenské mutace v Brně Oddělení klinické hematologie FN Brno - Bohunice

Nositelé vadného genu CF – odolnost vůči onemocnění tyfem !!

Otázky Proč jsou pacienti s b-talasemií většinou složení heterozygoti ? V jaké situaci byste očekávali, že pacient s b-thalasemií má dvě identické alely genu pro b-globin ? Dítě zemřelo na fetální hydrops. Nakreslete rodokmen s genotypy, který rodičům, kteří jsou nosiči, ukáže dědičnou podstatu talasemie, jíž jejich dítě trpělo. Dítě má strýce z otcovy strany a tetu z matčiny strany se srpkovitou anémií. Oba jeho rodiče jsou zdrávi. Jaká je pravděpodobnost, že jejich dítě bude mát abnormální hemoglobin ?

Příklady Onemocnění galaktosemie se dědí jako autozomálně recesivní znak. Zdravá dvojice má postižené dítě. Jaká je pravděpodobnost, že nastanou následující situace: A) následující dvě děti budou mít galaktosemii B) otec dítěte s galaktosemií je heterozygotem ve sledovaném znaku C) dítě, které má zdravá sestra nemocného je heterozygotem ve sledovaném znaku D) jakýkoliv potomek bude nemocný E) nevyskytne se žádný nemocný potomek u 3 následujících dětí F) jakékoli dítě bude dívka s galaktosemií, zdravý chlapec ?