prof. Ing. Václav Řehout, CSc. Biochemická genetika prof. Ing. Václav Řehout, CSc.

Biochemická genetika – Součást genetického polymorfismu Morfologický Detekovatelný vizuálními metodami. Imunologický Detekovatelný imunologickými metodami. DNA Detekovatelný molekulárně biologickými metodami. Biochemický Detekovatelný biochemickými metodami, zejména elektroforézou.

Biochemický polymorfismus Jeho fenotypovou podstatou Je výskyt několika funkčně nebo strukturně odlišných variant jednoho a téhož proteinu, jehož syntéza je řízena z jednoho lokusu. Jeho genotypovou podstatou Je výskyt více jak jedné alely alternující na jednom chromozomálním lokusu.

Každá alela determinuje jinou variantu téhož proteinu Genetická determinace Každá alela determinuje jinou variantu téhož proteinu (lišící se ve struktuře nebo funkci) Jeden protein – jeden lokus neboli každý protein – jiný lokus Homozygotní lokus Jedna varianta proteinu. Heterozygotní lokus Dvě varianty proteinu.

Život - Země - Bílkoviny Na Zemi např. 20 milionů živočichů a rostlin. Každý druh 100 – 10 000 různých duhů bílkovin. V téže bílkovině mezidruhové rozdíly. Například hemoglobin skotu a koně. Výsledkem je existence miliard variant bílkovin na Zemi.

Varianta proteinů je dána: Primární strukturou Dána počtem a pořadím aminokyselin v řetězci bílkoviny. Geneticky vzniká translací mRNA. Sekundární strukturou Je dána prostorovým uspořádáním bílkoviny. Není pravděpodobně geneticky řízena a je dána interakcí mezi jednotlivými aminokyselinami, což vytváří prosto- rovou variabilitu. Kvarterní strukturou Je dána počtem řetězců tvořících bílkovinu. (např. alfa a beta řetězec hemoglobinu.) Každý řetězec determinován vlastním genem.

Identifikace polymorfních variant proteinů – základní metoda ELEKTROFORÉZA Umožňuje rozdělení směsi polymorfních variant na základě: Rozdílů ve velikosti molekuly. (Dělení v porézném nosiči.) Rozdílů ve velikosti elektrického náboje. (Dělení v elektrickém poli.) ELFO na škrobovém gelu (agaroze – porezní materiál) Čím menší molekula, tím rychlejší prostup agarozou. Čím vyšší el. náboj, tím rychlejší postup k opačnému pólu.

Identifikace polymorfních variant proteinů – schéma ELFO + Katoda ELFO VANA s vodivým roztokem Směry migrace proteinů Agarozová deska Zářezy pro vzorek proteinu - Anoda

Identifikace polymorfních variant proteinů – foto ELFO

Schematické znázornění pohyblivosti hemoglobinu skotu (elekroforeograf)

Typy biochemické variability proteinů Variabilita bez detekovatelné změny aktivity (Struktura proteinu změněna, funkčnost nezměněna.) Variabilita ve struktuře proteinu Při současné změně funkce proteinu (aktivity enzymu). Při současné změně v množství vznikajícího proteinu. Chybění bílkoviny Taková mutace genu, která blokuje vznik proteinu.

V heterozním genotypu projev obou alel. Genetická determinace biochemického polymorfismu Kodominance Je nejčastější. V heterozním genotypu projev obou alel. Recesivita s nulovým fenotypem Je vzácná. Nulová alela nedeterminuje žádnou variantu proteinu (nebo v nedetekovatelné míře). Recesivita nebo dominance Klasický typ dědičnosti u morfologického polymorfismu. Méně častý u polymorfismu biochemického. Vznik jedné varianty polymorfního proteinu řízen z více lokusů. Vzácný typ dědičnosti. Vícemolekulární proteiny (1.lokus) s různým počtem prostetických skupin (2. lokus).

Polymorfismus proteinů – terminologie Polymorfní systém Polymorfní varianta Genotyp

Polymorfismus proteinů – terminologie Polymorfní systém Polymorfní varianta Genotyp Je určitý, konkrétní druh bílkoviny. Zahrnuje varianty téhož proteinu, tj. jednoho polymorfního systému Je děděn z jednoho chromozomálního lokusu Je označován značkou, zkratkou příslušného druhu bílkoviny (Hb-hemoglobin, Am-amyláza, Tf-transferin atd.).

Polymorfismus proteinů – terminologie Polymorfní systém Polymorfní varianta Genotyp Je určitý, konkrétní druh bílkoviny. Je varianta konkrétního druhu proteinu (zjištěná např. elektroforeticky). Zahrnuje varianty téhož proteinu, tj. jednoho polymorfního systému Je determinována jednou z alel polymorfního genu. Označuje se zkratkou a zpravidla písmenem označujícím alelu (Tf A, Tf B, Hb A, atd.). Je děděn z jednoho chromozomálního lokusu Je označován značkou, zkratkou příslušného duhu bílkoviny (Hb-hemoglobin, Am-amyláza, Tf-transferin atd.).

Polymorfismus proteinů – terminologie Polymorfní systém Polymorfní varianta Genotyp Je určitý, konkrétní druh bílkoviny. Je varianta konkrétního druhu proteinu (zjištěná např. elektroforeticky). Je značen zkratkou polymorfního systému a písmenem označující alelu v horním indexu . Zahrnuje varianty téhož proteinu, tj. jednoho polymorfního systému Je determinována jednou z alel polymorfního genu. Genotyp je pak zpravidla udáván zlomkem. Označuje se skratkou a zpravidla písmenem označujícím alelu (Tf A, Tf B, Hb A, atd.). Je děděn z jednoho chromozomálního lokusu Příklad: TfA/TfA - homozygot TfA/TfB – heterozygot Je označován značkou, zkratkou příslušného duhu bílkoviny (Hb-hemoglobin, Am-amyláza, Tf-transferin atd.).

Je kombinace polymorfních variant v rámci každého polymorfního systému Polymorfismus proteinů – Polymorfní typ proteinu Je kombinace polymorfních variant v rámci každého polymorfního systému Jedinec může mít v zásadě: Jednu variantu (je-li homozygot) např.: Tf A nebo Dvě varianty v rámci každého polymorfního systému (je-li heterozygot např.: Tf AB

Souhrn polymorfních variant všech detekovaných druhů proteinů Polymorfismus proteinů – Proteinový polymorfní typ Souhrn polymorfních variant všech detekovaných druhů proteinů u konkrétního jedince např. jedinec č. 241: Tf AB, Hb A, Am AC, Lg CD, atd.

Čtyři typy hemoglobinových řetězců (alfa, beta, gama, delta). Příklad polymorfismu lidského hemoglobinu Čtyři typy hemoglobinových řetězců (alfa, beta, gama, delta). Každý řetězec determinován samostatným genem. Každý z řetězců, tedy každý z genů, je polymorfní. Dosud zjištěno více jak 250 polymorfních variant hemoglobinu. Ne každá varianta je však patologická. Např. normální varianta Hb (HbA) má na určitém místě v molekule kyselinu glutamovou. Mutace, způsobující nahrazení této aminokys. valinem (HbS) vede ke vzniku srpkovité anemie. (Zhoršený přenos kyslíku.)

Heterozygoti HbA/HbS mají normální i patologický hemoglobin Příklad polymorfismu lidského hemoglobinu Heterozygoti HbA/HbS mají normální i patologický hemoglobin - v dobrých podmínkách bez projevu - např. ve vyšších nadm. výškách již projev anemie v malarických oblastech selekční výhoda – odolnost proti malárii v těchto oblastech proto frekvence defektní alely častější než jinde Homozygoti HbS/HbS s projevem srpkovité anemie vždy Zcela zdravý člověk je pochopitelně homozygotem HbA/HbA

Příklad polymorfismu lidského hemoglobinu Srpkovitá anémie nemoc je způsobena pozměněnou molekulou hemoglobinu: v šesté pozici β-globinového řetězce je místo kyseliny glutamové zařazen valin

Příklad polymorfismu lidského hemoglobinu Srpkovitá anemie

Srpkovitá anémie Počátkem 70. let se v USA rozběhl sickle cell anemia screening program, který „probably provides an example of all the mistakes that need to be avoided in such a program.“ program byl zaměřen na Afroameričany, s vysvětlením, že se jedná o nakažlivou chorobu pokusy zabránit dvěma heterozygotům uzavřít manželství pokusy odmítnout heterozygotům zdravotní pojištění pokusy odmítnout přijetí heterozygotů do některých zaměstnání, jako byla US Airforce Academy

Polymorfismus mléčných proteinů a určení jednotlivých genotypů Významné genotypy jsou vyznačeny tmavě.

Část genetické mapy šestého chromozomu skotu

Lokalizace genů mléčných proteinů v genomech ovce a kozy (umístění na chromozomech)

Cytogenetická mapa 6. chromozomu ovcí

Klasifikace polymorfních proteinů Podle druhu rostlin nebo živočichů ( Polymorf. proteiny skotu, koní, ovcí, atd.) Různé druhy mají stejný protein co do funkce (např. hemoglobin), ale s odlišnou strukturou. Podle místa, tkáně, výskytu Polymorfní proteiny mléka, krevního séra, erytrocytů, vaječného bílku aj. Zvláštní skupina: ostatní polymorfní proteiny.

Uveden v následujících tabulkách. Přehled polymorfních systémů hospodářských zvířat Uveden v následujících tabulkách. Není vyčerpávajícím přehledem. Kontinuálně jsou detekovány polymorfismy u stále dalších a dalších proteinů. Stejně tak jsou detekovány i další mutace – alely determinující další polymorfní varianty. Rozsah polymorfismu (počet polymorfních proteinů) a jeho stupeň (počet alel) Postup vědeckého poznání

Přehled hlavních polymorfních proteinů u skotu Polymorfní systém Značení Alely Poznámky Sérové proteiny albumin Al A, B (=F, S), C, EZam,FZam, CEd., DZam, (=DEd.) v závorce je změna alkalická fosfatáza F A, O   amyláza I Am I A, B, C, ... celk. 7 alel, 3 běžné amyláza II Am II A, B (=b1,b2) změna značení ceruloplazmin Cp A, B, C postalbumin Pa F, S Sa2 globulin S transferin Tf A, D1, D2, E, B, F, N,GKenya, H, GS.Afrika celk. asi 14 alel, 4 běžné transferin SA TfSA S, s Erytrocytální proteiny hemoglobin Hb A, B, C, CRhod., ... celk. 7 alel, 2 běžné karbonická anhydráza Ca F, S, ... celk. 5 alel, 2 běžné kyselá fosfatáza Sep ? Mléčné proteiny kasein citlivý na vápník aS1 - Cn  A, B, C, D b - kasein b – Cn A1, A2, A3, B, C, Bz, D c - kasein c - Cn A1, A2, A3, B k - kasein k - Cn  A, B kasein citlivý na teplo TS – Cn a – laktoalbumin La A, B b – laktoglobulin Lg A, B, C, D, Dr Xanthinoxidáza XO Ostatní polymorfní systémy pankreatická karboxypeptidáza A CPA Val, Leu Alotypy makroglobulin Mc l, -

Přehled hlavních polymorfních proteinů u prasete Polymorfní systém Značení Alely Poznámky Sérové proteiny albumin Alb1 A, B, 0   amyláza I Am I A, B, C, BF amyláza II Am II A, B amyláza III Am III arylesteráza Ar a, A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8 ceruloplazmin Cp A, B, C esteráza Es hemopexin Hpx 0, 1F, 1, 2, 3F, 3, 4, 5 haptoglobin (+), (-) v lit. rovněž pod označením haptoglobin také Hp5 postalbumin Psta postalbumin I Psta I A, B, ... Psta II F, S prealbumin Pa proteázový inhibitor (Pi-1) Pi-2 Sa2 globulin Sc2 transferin Tf A, B, C, D, E, P fosfoglukomutáza PGM-2 adenozin deamináza ADA

Polymorfní systém Značení Alely Poznámky Erytrocytální proteiny 6-fosfoglukonázdehydrohenáza 6-PGD A, B vazba s HAL lokusem fosfohexózoizomeráza PHI kyselá fosfatáza Acp   adenozin deamináza Ada A, B, 0 karbonická anhydráza Ca II kataláza Cat 2 esteráza - D Es-D peptidáza - C Pep-C fosfoglukomutáza Pgm-2 Mléčné proteiny b 1- kasein b1 - Cn B, C také pod označením AB b - laktoglobulin b - Lg b 2- kasein b 2- Cn X - protein XB A, B, C, D, E, P Z - protein Z-Cn Ostatní polymorfní systémy laktátdehydrogenáza C C, C'  spermie protein BAA BAA A, a sekret nadvarlete protein BAC BAC protein KI K I semenná plazma Protein KII K II A, B, C  semenná plazma sorbitoldehydrogenáza SDH A1, A2  játra,ledviny,štítná žláza, varlata vazopresin VP LVP, AVP Alotypy imunoglobulin G1 b - lipoprotein LDL Lpp-1, Lpp-2, Lpp-3

Přehled hlavních polymorfních proteinů u ovce Polymorfní systém Značení Alely Poznámky Sérové proteiny albumin Al F, S, W, V   alkalická fosfatáza (*) *dosud nepotvrzeno nebo neoznačeeno A esteráza Es a, b, c prealbumin Pr S, F, 0 XO F, M, S transferin Tf A, B, C, D, E, G, P, I, M, HCech., KCzech., NHun , U, V Erytrocytální proteiny diaforáza Di 1, 2 hemoglobin Hb A, B, C, D lyzin Ly L, l glutation GSH 1 a, A GSH 2 h, H karbonická anhydráza CA F, S X - protein X, x Mléčné proteiny a - kasein a - Cn  *dosud neoznačeno b - laktoglobulin A, B Ostatní polymorfní systémy draslík Ke L, h rozdíly v kvantitě Alotypy imunoglobulin c 1 Im 1 c 1a, c 1b imunoglobulin c 2 Im 2 c 2a b - lipoprotein Lp 1, - a - 2makroglobulin Ap

Přehled hlavních polymorfních proteinů u koně Polymorfní systém Značení Alely Poznámky Sérové proteiny albumin Al 2-3   esteráza Es F, I, S, O aj. cholinesteráza Ch A, B, C, D prealbumin Pr F, I, L, S, N, T, U, W Xk F, K, S transferin Tf D, H, M, O, R, F1, F2 postalbumin Pa PaO, PaF, PaS amyláza Am 2 ceruloplazmin Cp plasminogen PLG Erytrocytální proteiny 6-fosfoglukonázdehydrohenáza PGD D, F, S hemoglobin Hb A, B I, B II karbonická anhydráza CA F, I, L, O, S kataláza Cat F, S kyselá fosfatáza AcP B, A diaforáza Dia fosfoglukomutáza PGM fosfohexoizomeráza PHI 3 imunofixation elektrophoresis Ge

Přehled hlavních polymorfních proteinů u kuru Polymorfní systém Značení Alely Poznámky Sérové proteiny albumin Alb F, S, C   alkalická fosfatáza Akp Akp, akp a - amyláza Amy-1 B, A esteráza Es A, B, C Es-2 A, B pravděpodobně alisteráza leucinaminopeptidáza (*) 1, 2 *dosud neoznačeno prealbumin Pa ve žloutku protein vážící riboflavin Rd Rd, rd také v bílku transferin Tf také ve žloutku Erytrocytální proteiny hemoglobin c, c1 také m1, m2 kataláza Ct * dosud neozačeno Proteiny vaječného bílku ovoalbumin Ov ovoglobulin G2 F2 ovoglobulin G3 G3 A, B, J, M, AF prekonalbumin Ostatní polymorfní systémy Es-3 A, B, 0 alisteráza, v játrech, ledvinách a slezině kyselá fosfatáza Acp-3 Alotypy imunoglobulin a b c 1, 2, 3, 4

Funkce TfA oproti funkce TfB ????? Využití biochemického polymorfismu (proteinů) Hledání rozdílu ve funkci jednotlivých variant proteinů Funkce TfA oproti funkce TfB ????? Hledání rozdílů mezi jednotlivými genotypy (fenotypy) Funkce TfA/TfA oproti funkce TfB/TfB oproti TfA/TfB ????? Mezi mnoha variantami (genotypy, fenotypy) rozdíly nedetekovatelné Charakteristika populací – mezipopulačních rozdílů Určení parentity (dnes nahrazováno spíše DNA analýzou) a další

Vztah genetických variant mléčných proteinů s parametry zpracování mléka koz

Význam jednotlivých genotypů kapa kaseinu pro výrobu sýrů

Vybrané alely lokusu alfa1-antitrypsinu v různých populacích   Frekvence alel Populace M1 M2 M3 S Z Ostatní USA - běloši 0,724 0,137 0,095 0,023 0,014 0,007 USA - Afroameričané 0,981 - 0,015 0,004 Dánsko 0,728 0,136 0,082 0,022 0,009 Portugalsko 0,510 0,260 0,053 0,150 0,018 Čína (průměr 5 populací) 0,709 0,209 0,070 0,012 Japonsko 0,785 0,153 0,062