Detekce bodové mutace v genu pro LDL receptor Hyperlipidémie Detekce bodové mutace v genu pro LDL receptor

(hyperlipoproteinémie, HLP) Zvýšený obsah lipoproteinů v plazmě (hyperlipoproteinémie, HLP) - spojen s celou řadou chorobných stavů v centru zájmu: jeden z nejvýznamnějších rizikových faktorů předčasné aterosklerózy a kardiovaskulárních komplikací. míra rizika vzniku kardiovaskulárních chorob závisí na rizikových faktorech (hypertenze, diabetes mellitus, obezita, kouření, snížená funkce štítné žlázy, zvýšená hladina homocysteinu, nadměrná konzumace alkoholu atd).

Navržená klasifikace na základě genetiky dělí hyperlipoproteinémie na : “monogenně” podmíněné např. familiární hypercholesterolemie a polygenně podmíněné např. familiární kombinovaná hyperlipidemie.

Studium HLP - analýza a identifikace kandidátních genů, jejichž odchylky by mohly mít vztah ke vzniku onemocnění.

Molekulární biologie v medicíně: - identifikace mutací v genech, - interakce mezi jednotlivými geny, - mezi geny a prostředím. Na základě těchto informací lze vyhodnotit vztah genotypu k příslušnému fenotypickému obrazu daného onemocnění.

Familiární hypercholesterolemie vzniká odchylkou LDL-receptorového genu - mutace vedou k porušené vazbě receptoru s LDL částicemi, což má za následek zvýšenou hladinu LDL-cholesterolu v plazmě. Gen pro LDL receptor leží v oblasti 19p3. -p3.3, obsahuje 18 exonů (17 podléhá translaci). Aktivní protein je dlouhý 839 aminokyselin. Dosud bylo popsáno téměř 700 mutací rozptýlených po celé délce genu, všechny s velmi nízkou frekvencí.

Hodnoty LDL-cholesterolu bez léčby svědčící pro familiární hypercholesterolémii: Věk Hodnota LDL cholesterolu do 20 let 6,2 mmol/l a více 20-29 let 6,7 mmol/l a více 30-39 let 7,2 mmol/l a více nad 39 let 7,8 mmol/l a více fyziolofická hodnota LDL-cholesterolu < 3,4 mmol/l

Detekce mutace R395W - jedna z nejčastějších mutací LDL receptoru, způsobena záměnou G za T na úrovni nukleotidů, vede k záměně aminokyselin argininu za tyrozin v pozici 395 (GGG TGG). SNP - single nuclotide polymorphism záměny jedné báze na úrovni nukleových kyselin, inzerce a delece, které znamenají změnu genetické informace. V současné době jsou asociovány s predispozicí k multifaktoriálním onemocněním.

Běžná lidská buňka DNA na buňku 6 pg Celková RNA na buňku 10 - 30 pg Celková RNA v jádře ~14% DNA:RNA v jádře 2:1 Velikost lidského genomu (haploidní) 3.3 x 109 bp Kódující sekvence 3% Počet genů 0,3 - 1 x 105 Aktivní geny 1,5 x 104

Lidská krev leukocyty trombocyty erytrocyty Buněk na ml 4-7 x 106 3- 4 x 108 5 x 109 DNA 30- 60 g/ml - - (6 pg/buňku) RNA 1- 5 g/ml krve - - Hemoglobin - - 150 mg/ml Plazmové proteiny - 60- 80 mg/ml -

GEN Jednotlivé části - EXONY - INTRONY - PROMOTORY Alely – varianty genu Lokus – pozice genu na chromozomu Homozygot – stejné alely na lokusu Heterozygot – odlišné alely na lokusu

SNP - single nuclotide polymorphism

PCR Polymerázová řetězová reakce (PCR) (objevena v roce 1983 Dr. Kary Mullis - Nobelova cena 1993) je metoda umožňující namnožení specifického fragmentu (sekvence) DNA v miliónech kopií za pouhých několik hodin.

PCR - polymerázová řetězová reakce DNA

PCR - ANIMACE

Restrikční endonukleázy jsou bakteriální enzymy, které štěpí dvouřetězcovou DNA ve specifických místech

Gelová elektroforéza - ELFO

ELFO

Výsledky po restrikční analýze studovaného fragmentu

Další využití DNA a RNA diagnostiky

Patogenní střevní bakterie detekce ze stolice - multiplex PCR Chlamydia trachomatis z tamponů a histologických řezů - detekce pomocí PCR a sekvenace Chlamydia pneumoniae analýza monocytů - RT-PCR Bordetella pertussis detekce z nasopharyngealích tamponů - PCR s následnou immunoanalýzou Legionella pneumophila detekce v bronchoalveolarní lavaži - PCR Periodontální bakterie identifikace bacterií v gingivitis - multiplex PCR Pneumocystis carinii genotypové studie vzorků izolovaných z bronchoalveolarních vzorků Různé bakterie 16S-rRNA fragmentů genu - RT-PCR a sekvenace Mycobakterie detekce a identifikace v paraffinových vzorcích plic - PCR

Viry Chřipka - A virus molekulární identifikace kmenů Lidský adenovirus subgenera detekce v klinických vzorcích - multiplex PCR Enterovirus a Herpes simplex virus detekce virových nukleových kyselin v cerebrospinální tekutině - multiplex PCR Viral genotypizace izolace z plazmy Monitoring virové zátěže vysoce senzitivní kvantifikace z mononukleárních buněk periferní krve a biopsií

Plísně a paraziti Candida a Aspergillus izolace DNA z kultur a krve Druhy Leishmania detekce v tkáňových biopsiích - PCR Trichomonas vaginalis detekce z cervikálních tamponů a moči - PCR

Minimální Reziduální Nemoc Monitoring folikulárního lymfomu pomocí PCR - detekce asociované translokace t(14:18) - obr. - detekce tumor-specifické sekvence CDRIII

Nekompatibilita krevní skupiny Rhesus (Rh) mezi matkou a plodem Fetal DNA was isolated from two amniotic-fluid samples using the QIAamp Viral RNA Mini Kit. Individual PCRs contained primer sets specific for the RH sequences (83–158 bp) indicated, as well as hGH (434 bp) as internal control. D2–D10 refer to the specific exons targeted within the RHD gene. c(cyt48) refers to a sequence variant of the RHc allele. A RH genotype: CCD.ee; B RH genotype: ccddee. M: DNA molecular weight marker V (Boehringer Mannheim).

Multiplex PCR typing DNA izolovaná ze stop slin na oharku cigarety V - oběť 5 shodných S - podezřelý 6 shodných neznámá osoba 17