Fluorescenční a fotoaktivovatelné sondy Jaroslava Hniličková

Co jsou to fluorescenční metody, možnosti jejich použití Vlastní a nevlastní fluorescence Fluorescenční značky Fluorescenční sondy Příklady použití fluorescenčních sond

Fluorescence Fluorescence - schopnost některých látek po ozáření - excitaci světlem určité vlnové délky vyzařovat - emitovat světlo jiné vlnové délky Stokesův posun Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima Emitované záření má větší vlnovou délku (nižší energii)

Fluorescenční metody, možnosti použití Využití fluorescence Biochemický a biofyzikální výzkum Enzymové reakce, transport membránou, přenos signálu, studium neurotransmiterových receptorů a iontových kanálů, hledání vazebného místa v biomolekule Klinická chemie Genetické analýzy, genetické manipulace Analýza DNA Biomedicína Nahrazení metod využívajících radionuklidové zářiče Výhoda – možnost studia pochodů v živých buňkách

Výhody fotoafinitních sond Afinitní sondy – nevýhody: možnost deaktivace, hydrolýzy ještě před navázáním na vazebné místo možnost interakce na jiném než vazebném místě Fotoaktivovatelná sonda: Chemicky inertní sonda chemicky reaktivní ozáření

Používané přístroje Přístroje: Fluorimetry Spektrofluorimetry Fluorescenční skenery Fluorescenční mikroskopy Průtokové cytometry Princip přístrojů využívajících fluorescenci

excitační monochromátor Měření fluorescence vzorek emisní monochromátor detektor zdroj excitační monochromátor čtecí zařízení Fluorimetr Jenway řady 6200

Fluorescenční mikroskopy Fluorescenční mikroskop XFT 313 FL 2002 K – Fluorescenční mikroskop

Software Leica Application Suite Advance Fluorescence je modulární systém pro základní i profesionální práci s fluorescenčním obrazem.

Endotelové buňky pod mikroskopem . Endotelové buňky pod mikroskopem Fluorescenční mikroskop se třemi kanály umožňuje zobrazení jednotlivých částí buňky (mitochondrie, cytoskelet, jádro)

Vlastní a nevlastní fluorescence Vlastní fluorofory (vnitřní, intrinsic) vyskytují se přirozeně Proteiny (aromatické aminokyseliny, např. fenylalanin), vitamin A, cytochromy, hemoglobin, chlorofyl Nevlastní fluorofory (vnější, extrinsic) jsou přidány ke vzorkům, které nemají vhodné fluorescenční vlastnosti Použití nevlastních fluoroforů je mnohem častější než použití vlastních

Nevlastní fluoroscence Fluorescenční značky látky přidané ke studovanému vzorku, které se váží kovalentně fluorescenční značení proteinů Fluorescenční sondy látky přidané ke studovanému vzorku, které se váží nekovalentně Požadované vlastnosti specifická vazba na buněčné složky citlivost emise na změny v okolí podobnost s původní sloučeninou po zavedení fluoroforu nesmí dojít k narušení biologických systémů

Principy fotoafinitního značení Biologicky aktivní Chemicky stálé bez přítomnosti světla – možnost skladování Stálé v podmínkách experimentu Krátký poločas – minimalizace nespecifického značení Vysoká specificita Snadná syntetická dostupnost Stálost aduktu v podmínkách použitých analytických technik (elektroforéza, hmotnostní spektrometrie)

Principy fotoafinitního značení Fotoreaktivní skupina – modrá Radioizotop – červený Protein - zelený

Chemické struktury barev Alexa

Emisní spektra pro Alexa Fluor barevné serie

Alexa Fluor Cadaverine 647

Syntéza AFCS DCC: Dicyklohexylkarbodiimid, CMO.HCl: karboxymethyloxim hydrochlorid, NHS: N-Hydroxyskcinimid

Specifičnost absorpce AFCS Absorpce fluoroforu AF647 minimální ve srovnání s absorpcí AFCS Snažší absorpce způsobena CS částí molekuly

Rychlá absorpce AFCS Šipky ukazují endosomy označené AFCS

Pohyb AFCS v buňkách Signál AFCS se rychle ztrácí z PM a akumuluje se ve vakuolách

Pohyb AFCS v buňkách AFCS je v PM, endozomech (označeno šipkami) a hromadí se ve vakuolách

AFCS putuje z PM do vakuol

Význam AFCS Vývoj bioaktivního fluorescenčně značeného brassinosteroidu BR Alexa Fluor 647 kastasteron (AFCS) umožňuje pozorování endocytózy komplexů BR1-ligandu v živých buňkách. Užitím různých endomembránových značek lze mapovat endocytickou cestu komplexu BRI1-AFCS z plasmatické membrány do vakuol.

Příprava steroidu pro navázání Alexy

Příprava steroidu pro navázání Alexy

Příprava aktivního esteru Alexy ethyldiisopropylamine, (O-(N-succinimidyl)-1,1,3,3 tetramethyluronium tetrafluoroborate, H2O, DMF, 0 °C

Alexa navázaná na steroid

DHEA (1), Photo-DHEA (2), a DHEA-Bodipy (3)  

Další fluorofory 7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol

BODIPY boron-dipyrromethene Skupina fluorescenčních značek, jejichž fluorofor obsahuje bór Použití: značení proteinů, nukleotidů, enzymových substrátů, mastných kyselin, fosfolipidů boron-dipyrromethene 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene

Struktury BODIPY

Dansylchlorid DNS-Cl 5-dimethylaminonaftalén-1-sulfonyl chlorid Reaguje s volnými aminoskupinami proteinů DNS-Cl 5-dimethylaminonaftalén-1-sulfonyl chlorid

Fluorescentní steroly pro studium pohybu cholesterolu v živých buňkách

Závěr Využití fluorescence – nedestruktivní způsob sledování a analýzy biologických molekul prosřednictvím fluorescenční emise o určité frekvenci. Existuje velká řada vnějších fluoroforů, takže je možnost výběru toho nejvhodnějšího. Přehled je možno nalézt na stránkách www.molecularprobes.com

Literatura Gimpl G. Gehrig-Burger K.: Probes for studying cholesterol binding and cell biology. Steroids 76 (2011) 216–231 Waschatko G. et al.: Photo-DHEA—A functional photoreactive dehydroepiandrosterone (DHEA) analog. Steroids, 76 (2011), 502-507 Irani N. G. et al.: Fluorescent brassinosteroids trace the endocytic route of BRI1, k tisku Borovska J. et al.:. Neurosteroid access to the NMDA receptor, k tisku www.molecular probes.com

Děkuji za pozornost