Vstupy centrálních regulátorů: checkpoints – reakce na poškození a zpětná vazba

„cell cycle engine“ vstupy výstupy velikost signály poškození... gen. exprese morfogeneze...

??? Why do events occur in a particular order? How are superficially unrelated events kept in phase? How are growth and division co-ordinated? How does the cell know where to locate new structures? (A.E. Wheals, 1976)

L. Hartwell a T. Weinert, léta cdc9

Ale proč??

K čemu je dobrá ligáza?

Je zástava cyklu důsledkem zlomů DNA?

Mutace zvyšující citlivost ke zlomům: rad (radiation sensitive) wt rad9 UV (mrtvé se barví methylenovou modří)

UV dělá zlomy... a co defekt ligázy?? wt, 37 o C rad9, 25 i 37 o C (občas ztráta chromosomu) cdc9, 37 o C cdc9rad9, 37 o C RAD9 nutný k bloku cyklu při poškození! (Hartwell and Weinert 1988)

Model „kontrolních bodů“ (checkpoints) Existují mechanismy, které průběžně monitorují úplnost a „zdraví“ důležitých mechanismů BC a v případě poruchy cyklus zastaví, aby byl čas na opravu. RAD9 je součástí dráhy, která takto monitoruje celistvost DNA (DNA damage checkpoint). poškozená DNA v S nebo G2/M G2  M

Jak funguje RAD9 checkpoint? 2 epistatické třídy RAD genů –RAD17, RAD24, MEC3 a DDC1 –RAD9 protein kináza MEC1 – detektor?

(Melo and Toczyski 2002)

Cíl 1: transkripce cyklinů (CLN via SCB, CLB via MCB)

Cíl 2: replikace - přes primázu

Cíl 3: securin (inhibitor separace chromosomů, substrát APC, který vyvazuje separasu)

Tenodera aridifolia sinensis Replikace není jediným zdrojem rizika...

Chromosomové určení pohlaví u kudlanky ♀: X 1 X 2 ♂: X 1 X 2 Y

Anafázi lze obnovit mechanickým tahem za kinetochor! (Li a Nicklas 1995) Anafáze Blok Anafáze

Jak kinetochor ví, že se za něj tahá? (anti-phosphoprotein Ab)

(Li and Nicklas 1997)

Jak je to u kvasinek? benomyl – destrukce vřeténka a M arrest MAD/BUB geny: mitotic arrest deficient/budding uninhibited by benomyl wt, benomyl mad/bub, benomyl

„Spindle checkpoint“ Aktivace u kvasinek: –benomyl, nocodazol a jiné mt jedy –mutace SPB –mutace centromer (CDEIII) –nadpočetné centromery (mnoho různých YCp) Aktivace u hmyzu: –nepřichycené chromosomy

Blok anafáze: via APC

Co když se chromosom ztratí později? Bub2: část „dvousložkového“ GAP (připomínka: Cdc14 je fosfatáza nezbytná pro mitotic exit)

Regulace přechodu Ana/Telo

Spindle checkpoint - cíle securin/separáza transkripce CKI telofázní regulátor APC

A to ještě není vše! cdc24 cdc42 (1995) Proč jsou Hartwellovi mutanti dvojjaderní, ale v jiném genetickém backgroundu jen 1 G2 jádro?

iniciace terminace segregace Absence pupene zdržuje mitosu!

Obecně: cell morphogenesis checkpoint Senzor: proteinové komplexy asociované se septiny Cíl: inhibiční fosforylace CDC28 (Y19)! Y19F a někt. kmeny standardní wt

Pro kontrolu pupenem nutná fosforylace Y19 (homolog Y15) T14 Y15 T161 Y15 T14 T161 Y15 T14 Y15 T161 T14 Y15 T161 cdc25 wee1

Cíle – širší pohled (Saccharomyces wee1)

??? Why do events occur in a particular order? How are superficially unrelated events kept in phase? How are growth and division co-ordinated? How does the cell know where to locate new structures? (A.E. Wheals, 1976)

Kontrola velikostí: necyklující cyklin CLN3 SWI4/6 velikost CLN3 CLN1,2 START

Jaký to má vztah k živinám? A jak je kvasinka vnímá? „Start II“ mutace: –blok ve Startu bez růstu –„kvasinka si myslí, že hladoví“ CDC25: GEF pro RAS!

CDC25 stimuluje produkci cAMP Ras-GDP Ras-GTP Cdc25 Ira1,2 Cyr1 GEF GAP adenylátcykláza ATP AMP Pde fosfodiesteráza inhibice nebo stimulace Startu?

Regulace proteinkinázy A pomocí cAMP Cyr1 adenylátcykláza ATP AMP Tpk1,2,3 Bcy1 proteinkináza A (PK-A) Bcy1 ? (Bypass of Cyr) (zase jedna kináza regulovaná inhibitorem) (Cyr1: sporulace na bohatých médiích etc.)

Kvasinková RAS/cAMP dráha Ras-GDP Ras-GTP Cdc25 Ira1,2 Cyr1 GEF GAP adenylátcykláza ATP AMP Pde fosfodiesteráza Tpk Bcy1 proteinkináza A (PK-A) Bcy1 inhibice nebo stimulace Startu?

Předpokládali bychom, že cAMP stimuluje, ale... (M.D. Baroni, Milano, Italy – Nature 371:339, 1994 asynchronní kultura

... cAMP inhibuje BC, aby mohla vzrůst kritická velikost!  -factor release

cAMP zprostředkuje spřažení cyklu a růstu u S. cerevisiae Cíl regulace přes Tpk/PK-A: nastavení citlivosti transkripce CLN1 a CLN2 vůči hladině CLN3 Čím víc cukru, tím víc cAMP a tím víc CLN3 = větší velikost před startem! cAMP podobně reguluje i anafázi a mitotic exit (srv. S. pombe!) – inhibice APC prostřednictvím PK-A