Problematika volných radikálů a antioxidantů v medicíně Alice Skoumalová

Definice volných radikálů každá sloučenina schopná samostatné existence obsahující jeden nebo více nepárových elektronů vysoká reaktivita a schopnost iniciovat řetězové reakce produkce vystupňována během stárnutí a za patologických stavů Homolytické štěpení Heterolytické štěpení A : B A• + B• A : B A- + B+

Důležité pojmy Oxidace získání kyslíku C + O2 CO2 ztráta elektronu O2•- O2 + e- ztráta vodíku alkoholy ketony, aldehydy Redukce ztráta kyslíku CO2 + C 2CO získání elektronu O2 + e- O2•- získání vodíku C + 2H2 CH4 Oxidační činidlo x Redukční činidlo

Obecné schéma radikálových reakcí Dva radikály reagují spolu H• + H• H2 Radikál reaguje s neradikálem řetězová reakce adice OH• se váže na DNA redukce CO2•- + Cu+ CO2 + Cu oxidace pr + OH• pr•+ + OH- extrakce vodíku CH + OH• C• + H2O

Důležitá místa vzniku reaktivních forem kyslíku v organismu Neenzymaticky: dýchací řetezec mitochondrií, glykoxidace, autooxidace hemoglobinu Enzymaticky: cytochrom P450, NADPH-oxidáza, NO-syntáza, xantinoxidáza

Důležité reakce vzniku reaktivních forem kyslíku v organismu Vznik superoxidu O2 + e- O2•- Superoxiddismutáza O2•- + O2•- + 2H+ H2O2 + O2 Myeloperoxidáza H2O2 + Cl- + H+ HClO + H2O Fentonova reakce Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH• + OH- Haberova-Weissova reakce O2•- + H2O2 O2 + OH• + OH- Vznik peroxynitritu O2•- + NO• ONOO- Fe2+

O2•- H2O2 ONOO- OH• Inaktivace enzymů Poškození DNA Peroxidace lipidů Fe2+ ONOO- OH• Inaktivace enzymů Poškození DNA Peroxidace lipidů

Reaktivní sloučeniny Vlastnosti O2•- Superoxid Vzniká např. v dýchacím řetězci; generuje další ROS H2O2 Peroxid vodíku Může difundovat; reaguje s Fe2+ - tvorba dalších radikálů OH• Hydroxylový radikál Nejreaktivnější - poškození biomolekul; vzniká Fentonovou reakcí HOCl Kys. chlorovodíková Vzniká v leukocytech - ochrana před mikroorganismy ONOO- Peroxynitrit Silný radikál; vzniká reakcí O2•- a NO

Radikálové poškození buněk

Definice - antioxidanty látka, která chrání před oxidačním poškozením neexistuje universální antioxidant jaké radikály a kde jsou tvořeny Dělení: enzymy odstraňující volné radikály: SOD, kataláza, glutationperoxidáza proteiny snižující dostupnost prooxidantů (Fe2, Cu2+, hem): transferin, haptoglobulin, feritin nízkomolekulární látky vychytávající volné radikály: glutathion, α-tokoferol, kyselina askorbová

Příklad systému ochrany před volnými radikály - erytrocyty Hemoglobin 4 polypeptidové řetězce + 4 hemové skupiny O2 se váže na Fe2+ Hem - Fe2+- O2 Hem - Fe3+ - O2•- Methemoglobin (Fe3+) není schopen vázat O2 (methemoglobinreduktáza)

Oxyhemoglobin O2 Hemoglobin Superoxid H2O2 Methemoglobin ½ O2+H2O GSH Superoxiddismutáza Hemoglobin Superoxid H2O2 Kataláza Methemoglobinreduktáza Methemoglobin ½ O2+H2O GSH Pentosofosfátová dráha NADP+ Glutathionreduktáza Glutathionperoxidáza NADPH GSSG H2O GSH-redukovaný glutathion; GSSG-oxidovaný glutathion

Superoxiddismutáza (SOD) Konvertuje O2•- na H2O2 Ve vysoké koncentraci v erytrocytech Odstranění H2O2: 1. Kataláza Katalyzuje dekompozici H2O2 na vodu a kyslík: 2H2O2 2H2O+O2 2. Glutathionperoxidáza redukuje H2O2 na vodu a zároveň oxiduje glutathion H2O2+2GSH GSSG+2H2O Glutathionreduktáza GSSG+NADPH+H+ 2GSH+NADP+ NADPH z pentosafosfátové dráhy (glukóza-6-fosfátdehydrogenáza)

Redukovaný glutathion důležitý pro ochranu před volnými radikály kofaktor glutathionperoxidázy (odstraňování H2O2 v erytrocytech) Glutamát Cystein Glycin + H2O2 Gly Cys SH Glu Gly Cys Glu Gly Cys Glu Glutathionperoxidáza S S Glutathionreduktáza + NADPH (pentosafosfátová dráha) Redukovaný glutathion (monomer) Oxidovaný glutathion (dimer)

Nízkomolekulární antioxidanty (v potravě) α-tokoferol (vitamin E) v membránách chrání před peroxidací lipidů α-TocH+LO2• α-Toc•+LO2H Kyselina askorbová (vitamin C) v cytoplasmě recykluje α-tokoferol Dehydroaskorbátreduktáza regeneruje askorbát Karotenoidy, flavonoidy

Antioxidanty v plasmě (přehled) Transferin, laktoferin Váže železo, brání jeho pro-oxidační aktivitě Ceruloplasmin Oxiduje Fe2+ na Fe3+ bez uvolnění radikálů Erytrocyty Vychytávají O2•- a H2O2 Albumin Váže železo, meď, hem; vychytává reaktivní sloučeniny Haptoglobin/hemopexin Váže volný hem/hemoglobin, brání jejich pro-oxidační aktivitě Kyselina močová Inhibuje peroxidaci lipidů a vychytává reaktivní sloučeniny Vitamin E Chrání před peroxidací lipidů Glukóza Vychytává OH• Bilirubin Pravděpodobný antioxidant Melatonin Reguluje denní rytmy, antioxidant

Definice - oxidační stres nerovnováha mezi produkcí volných radikálů a antioxidatanty Volné radikály Antioxidanty Př. vyšší tlak kyslíku metabolismus toxinů chronické zánětlivé nemoci Př. mutace enzymů antioxidační ochrany deplece antioxidantů v dietě Důsledky: Adaptace x Buněčné poškození (peroxidace lipidů, poškození proteinů, DNA) - lýza - apoptóza - mutace

Průkaz oxidačního poškození Přímá detekce volných radikálů Detekce produktů radikálových reakcí („fingerprinting“) oxidační poškození DNA peroxidace lipidů (př. malonaldehyd, lipofuscinoidní pigmenty) oxidační poškození proteinů (př. karbonyly, nitrotyrosin) antioxidanty (př. vitamin E)

Vznik oxidačního stresu u nemocí Snížený účinek antioxidantů (př. snížená aktivita antioxidačních enzymů, snížení antioxidantů v potravě) Zvýšená produkce volných radikálů (př. metabolismus toxinů, zvýšená aktivace leukocytů) Důsledek oxidačního stresu u nemocí Adaptace (př. ischemický „preconditioning“) Poškození (př. chronické zánětlivé procesy) Buněčná smrt (př. neurodegenerativní choroby)

Volné radikály a nemoci Ateroskleróza Diabetes Ischémie-reperfůze Chronické zánětlivé choroby Nádory Neurodegenerativní choroby (př. Alzheimerova choroba)

Úloha volných radikálů v rozvoji Alzheimerovy choroby Neurofibrilární tangly: složeny z agregovaného a hyperfosforylovaného proteinu tau. Normální tau protein asociuje s tubulinem a vytváří mikrotubuly (tvar a struktury buňky, nitrobuněčný transport). Hyperfosforylace tau proteinu vede k disociaci s tubulinem a poruše buněčných funkcí, even. buněčné smrti. Stupeň fosforylace tau proteinu je dán aktivitou proteinkináz a fosfatáz. U AD hyperfosforylovaný tau protein agreguje intracelulárně. Amyloidní plaky: složeny z fibril amyloidu β, nachází se extracelulárně, ale původ intracelulární (neurony sekretují rozpustný peptid Aβ). První histopatologický znak AD. Plaky obsahují hlavně Aβ42, který vzniká v důsledku abnormálního zpracování APP (amyloid prekurzor protein). Neurofibrilární tangly Amyloidní (senilní) plaky - hyperfosforylovaný tau protein - fibrily proteinu β-amyloidu (Aβ) - abnormální zpracování APP (amyloid prekurzor protein)

Model Aβ-indukovaného oxidačního stresu u AD V mozku pacientů s AD je přítomen oxidační stres, jehož důsledek je buněčná dysfunkce a neurodegenerace. Přítomnost produktů peroxidace lipidů, oxidace proteinů a DNA. Zdroje zvýšené tvorby VR v mozku u AD jsou diskutovány různé: abnormální funkce mitochondrií, redox akticní ionty Fe a Cu, koncové produkty glykace proteinů (AGE), aktivované mikroglie a astrocyty, dysfunkce buněčného proteolytického systému, amyloid β. Aβ indukuje oxidaci za podmínek: agregace, přítomnosti iontů kovů a rezidua metionu 35. Aβ indukuje peroxidaci membránových lipidů, oxidaci proteinů, poškození DNA. Aβ jako antioxidant: vychytává ionty kovů, redukuje ionty kovů (Met 35), vychytává VR (Met 35). Ukládání Aβ ve formě plaků, kompenzační mechanismus oxidačního stresu u AD. Pozn. Aβ aktivuje přímo NADPH oxidázu mikroglií, indukuje NOS mikroglií a astrocytů, váže se na RAGE. 1. Aβ asociovaný oxidační stres - model neurodegenerace u AD: Aβ je přímo odpovědný za oxidační poškozená membrán neuronů (mechanismus není zcela jasný). Aβ peptid či malé agregáty insertují do membrány a iniciují tvorbu VR (podmínkou je pravděpodobně navázání redoxních iontů kovů). Dochází k peroxidaci lipidů a oxidaci proteinů. Toxické produkty LPO mohou migrovat, poškodit další proteiny (porucha homeostázy Ca, inhibice Na-dependentního vychytávání glutamátu, poškození transportních proteinů, signálních drah, aktivace nukleárních transkripčních faktorů a apoptózy - buněčná smrt). 2. Úloha amyloidních fibril v Aβ toxicitě: během procesu agregace vznikají VR. Ale: rozpustné oligomery Aβ (protofibrily, β-sheet intermediáty) jsou toxické! Přímý důkaz tvorby VR Aβ: elektronová paramagnetická rezonance. Metionin 35 v peptidu Aβ je odpovědný za produkci VR (když se nahradil jiným zbytkem, VR se netvořily). Váže ionty přechodných kovů. Je náchylný k oxidaci, důsledek tvorba β-struktur.

Souhrn – důležité pojmy Definice volných radikálů (proč jsou nebezpečné); místa vzniku v organismu Definice antioxidanty, dělení Oxidační stres a nemoci (příklady)