Volné radikály a antioxidanty oxidoredukční rovnováha – elektron acidobazická rovnováha - proton

Charakteristika radikálu radikál – částice s nepárovým elektronem ve valenčním orbitalu radikálová reakce iniciace propagace terminace

Reaktivní formy kyslíku - ROS superoxid O2 + e- = O2·- peroxid vodíku O2·- + e- + 2H+ = H2O2 hydroxylový radikál H2O2 + e- = OH- + HO· HO· + e- = OH- dizmutace peroxidu O2·- + O2·- + 2H+ = O2 + H2O2 Fentonova reakce H2O2 + Fe2+ = HO· + OH- + Fe3+

Reaktivní formy dusíku - RNS oxid dusnatý arginin + O2 = NO· + citrulin oxid dusičitý 2 NO· + O2 = 2 NO2· peroxynitrit NO· + O2·- = OONO-

Zdroje volných radikálů ROS a RNS v organismu membránově vázané enzymy s koenzymy: chinoidy, flaviny, hem, Cu redukují O2 na superoxid Respirační řetězec mitochondrií 1-4% O2 redukováno neúplně na ROS komplex I (NADH – ubichinonreduktáza) komplex III (ubichinol: cytochrom c- reduktáza)

Cytochrom P-450 v endoplazmatickém retikulu ROS vázané na enzym – biotransformace, oxidace ethanolu Specializované buňky – leukocyty, makrofágy NADPH – oxidáza v cytoplazmatické membráně – baktericidní ochranný systém myeloperoxidáza – produkce HClO Oxidace hemoglobinu na methemoglobin

Zdroje H2O2 dizmutace superoxidu: 2 O2·- + 2H+ = O2 + H2O2 samovolná enzym superoxiddizmutáza přímá redukce O2 působením oxidáz – monoaminooxidáza, glutathionoxidáza, xantinooxidáza - játra peroxizómy – oxidace org.substrátů (ethanol, mastné kys.) spotřebovávají O2 a tvoří peroxid

Neenzymové zdroje ROS chinonová antibiotika: adriamycin, daunomycin, streptonigrin, ... pyridiniové herbicidy: paraquat, diquat – poškození plic nízkomolekulární komplexy Fe s fosfáty, nukleotidy, ...

Zdroje oxidu dusnatého - NO· z terminálního atomu N argininu v přítomnosti O2 reakce katalyzovány syntázami oxidu dusnatého – NOS NOS I – mozková NOS II – makrofágová NOS III - endotelová

NO· O2 + NADPH

Funkce volných radikálů Volné radikály – nástroj oxidáz a oxygenáz nezbytné pro aerobní způsob života cytochromoxidasa v mitochondriích – redukce O2 4 elektrony, meziprodukty – superoxid a peroxid vázány na enzym monooxygenasy v endoplazmatickém retikulu jater nebo mitochondriích nadledvin – redukce O2 3 elektrony na ·OH – hydroxylace xenobiotik, syntéza cholesterolu a žlučových kys.

ROS a RNS účinná zbraň fagocytů proti bakteriím enzymový komplex NADPH-oxidáza v plazmatické membráně – superoxid, peroxid, uvolnění Fe – hydroxylový radikál myeloperoxidáza – syntéza HClO z H2O2 a Cl- NOS II – syntáza NO z argininu a NADPH, koncentrace NO vzroste o několik řádů, navíc NO + superoxid – OONO-

ROS a RNS jako signální molekuly informační síť: primární posel, sekundární posel, proteinkinázy – ovlivnění aktivity enzymu, exprese genu citlivost informační sítě závisí na redoxním stavu buňky - ovlivnění proteinkináz redoxní stav – kapacita antioxidačního systému, dostupnost redukčních ekvivalentů, intenzita oxidační zátěže (RONS) NO – prokázaně druhý posel, neurotransmiter v CNS a autonomním nervstvu, vazodilatace cév

Antioxidační ochranný systém omezení tvorby nadměrného množství ROS a RNS regulace aktivity enzymů vychytání tranzitních prvků z reaktivních míst zachycení a odstranění vzniklých radikálů vychytávače, lapače, zhášeče enzymy, látky tvořící s radikály stálejší produkty obecné reparační mechanismy poškozených makromolekul fosfolipázy reparační enzymy DNA proteolýza oxidačně poškozených proteinů

Enzymové antioxidační systémy H2O + ½ O2 kataláza SOD + Fe2+ O2·- H2O2 ·OH + Fe3+ + OH- 2 GSH NADPH+H+ GSHPx 2 H2O GSSG NADP+

Superoxiddizmutáza – SOD v každé buňce zrychluje dizmutaci superoxidu o 4 řády Cu, Zn – SOD (SOD1) dimer, v každé podjednotce atom Cu a Zn v cytosolu a mezimembránovém prostoru mitochondrií Mn – SOD (SOD 2) tetramer, u prokaryont a v mitochondriální matrix extracelulární – SOD (EC – SOD) tetramer, obsahuje Cu a Zn

Glutathionperoxidázy odstranění intracelulárních hydroperoxidů selenoproteiny – selonocystein v aktivním centru 2 GSH + ROOH = GSSH + H2O + ROH cytosolová GSH – glutathionperoxidáza (cGPx) rozkládá hydroperoxidy mastných kyselin po uvolnění z lipidů, H2O2 fosfolipidhydroperoxid-GSH-peroxidáza (PHGPx) redukuje fosfolipidové hydroperoxidy přímo v plazmatické membráně bez uvolnění mastných kyselin z fosfolipidů

Kataláza - KAT dvouelektronová dizmutace peroxidu vodíku 2H2O2 = 2 H2O + O2 inaktivace H2O2 – peroxisomy a mitochondrie hepatocytu, cytoplasma erytrocytu

Vysokomolekulární endogenní antioxidanty proteiny vážící Fe a Cu – inaktivace tranzitních kovů transferin – váže Fe3+ v plazmě laktoferin - váže Fe3+ v leukocytech feritin – intracelulární, má ferooxidázovou aktivitu, zásobárna Fe v buňce haptoglobin – vychytává extracelulární hemoglobin hemopexin – váže volný hem ceruloplazmin – v plazmě váže Cu albuminy – váží –SH skupinami Cu metalothioneiny – váží ionty kovů v jádře

Nízkomolekulární endogenní antioxidanty Kyselina askorbová – vitamin C redukuje radikály – O2·-, HO2·, HO·, RO2·, NO2 přechází na hydroaskorbát (askorbylový radikál) – málo reaktivní regenerace redukcí NADH nebo dizmutuje na askorbát a dehydroaskorbát redukuje Fe3+ na Fe2+ vstřebávání Fe ve střevě využití Fe v aktivním centru hydroxyláz s Fe působí prooxidačně

HO· + H2O R-O-O· + R-O-O-H

a – tokoferol a vitamin E vitamin E – skupina 8 izomerů – biologicky nejvýznamnější a-tokoferol antioxidant biologických membrán redukuje alkylperoxylové radikály LOO· lipidů na hydroperoxidy – ty poté redukovány glutathionperoxidázou přechází na málo reaktivní tokoferylový radikál regenerace askorbátem

Ubichinon/ubichinol – koenzym Q benzochinony s izoprenovým řetězcem – nejrozšířenější CoQ10 součást dýchacího řetězce v mitochondriích vyskytuje se ve všech membránách – s tokoferolem tlumí radikálové reakce Karotenoidy, b-karoten a vitamin A chemicky izoprenoidy odstraňují radikály centrované na uhlík a LOO· v lipidech

2e- + 2H+ R-O-O· +

Thioly a disulfidy – Glutathion GSH tripeptid- g-glutamylcysteinylglycin nejvýznamnější redoxní pufr buňky 2 GSH = GSSG + 2H+ + 2e- neenzymově odstraňuje ROS – HO·, RO·, ROO· udržuje v redukované formě –SH skupiny proteinů, cysteinu, CoA, regeneruje askorbát substrát glutathionperoxidáz

2 - 2e- - 2H+ + 2e- + 2H+

Kyselina lipoová kofaktorem pyruvátdehydrogenázy a a-ketoglutarátdehydrogenázového komplexu antioxidant ROO·, askorbylového radikálu, HO·, NO·, O2·- Kyselina močová konečný produkt odbourávání purinů nejdůležitější antioxidant plazmy vychytává RO·, HClO, váže Fe a Cu Další- bilirubin, flavonoidy, melatonin ...

2e- + 2H+ H + + R · + RH

Prolomení antioxidační ochrany oxidační stres – porušení rovnováhy mezi vznikem a odstraňováním ROS a RNS nadměrná produkce radikálů nedostatečná antioxidační ochrana příčiny nadměrné produkce ROS a RNS reoxygenace tkáně po ischemii po příjmu oxidoredukčně aktivních xenobiotik uvolněním Fe a Cu z vazeb na zásobní proteiny nadměrná produkce NO a překročení kapacity SOD NO + O2·- = peroxynitrit - silný oxidant

Klíčová úloha Fe při oxidačním poškození organismu Fentonova reakce Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + HO· + OH- Fe3+ + O2·- = Fe2+ + O2 katalytická schopnost Fe v aktivních centrech enzymů – substrát vybrán ku prospěchu organismu Fe takto reaguje i při nespecifické vazbě na proteiny, lipidy, NK – po úniku z transferinu a feritinu – poškození molekul lidské tělo – 4g Fe v oxidoreduktázách nepatrná část 70% v hemoglobinu, 10% v myoglobinu

Peroxidace lipidů - LPO in vitro – žluknutí olejů – autooxidační radikálová reakce in vivo – polyenové mastné kyseliny – peroxidace lipidů neenzymová – vyvolána nespecifickými patologickými faktory – štěpení MK na uhlovodíky – ethan, pentan a aldehydy – snížení fluidity membrán enzymová – hydroperoxydázami – produkce biologicky aktivních prostaglandinů

lipid HO· - H2O alkylový radikál O2 peroxylový radikál Fe alkoxylový radikál C2H6 alkan alkenal

Poškození proteinů oxidace aminokyselinových zbytků ROS a RNS methionin – methioninoxid cystein – kys. cysteinová arginin – aldehyd kys.glutamové prolin – kys.glutamová hydroxylace AMK HO· - aromatické AMK produkty lipoperoxidace – vazba na –NH2 lyzinu - agregace poškození –NH2 skupin v místech vazby na Fe

Poškození DNA reakce s HO· vyjmutí H z deoxyribózy – přerušení řetězce adice s bázemi – hydroxy- a oxoderiváty