10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 1 Oxidativní stres redoxní rovnováha poškození biologických makromolekul.

Prezentace na téma: "10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 1 Oxidativní stres redoxní rovnováha poškození biologických makromolekul."— Transkript prezentace:

1 10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 1 Oxidativní stres redoxní rovnováha poškození biologických makromolekul

2 10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 2 Chemiluminescence Chemiluminiscence (1) Luminofory jsou oxidovány RMKD. Při návratu do základního energetického stavu emitují fotony. Jejich detekce je možná pomocí luminometrů nebo scintilačních spektrofotometrů. Nejčastěji používané luminofory: - Luminol - Lucigenin - Izoluminol - Pholasin

3 10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 3 Chemiluminescence luminol isoluminol aminoftalát RMK

4 10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 4 CL fagocytů fagosom granule plazmatická membrána NADPH oxidasa

5 10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 5 CL fagocytů NADPH oxidasa NADP + (O 2 - , H 2 O 2, OH  ) O 2 - O2O2 NADPH + H + luminol + oxidant  -aminoftalát + N 2 + světlo (425 nm)

6 10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 6 CL fagocytů Rozlišení intra- a extracelulární CL SOD, kataláza, křenová peroxidáza, azid sodný luminol vs. isoluminol Streptococcus mutans

7 10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 7 CL fagocytů plazmatická membrána cytosol luminol isoluminol

8 10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 8 CL fagocytů Aktivátory fagocytůMísto působení opsonizované částice (OZP)povrchové receptory fMLPpovrchové receptory PMAproteinkinasa C vápníkový ionofor A23187Ca 2+ PKC

9 10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 9 Systémy generující RMKD xanthin/xanthin oxidázaO 2 - peroxid vodíku + ionty přech. kovů OH peroxid vodíkuH 2 O 2 ABAPROO SIN-1ONOO - buněčné systémy (fagocyty)

10 10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 10 Metoda TRAP Total (peroxyl) Radical-trapping Antioxidative Parameter stanovení celkové antioxidační kapacity ve vodě rozpustných antioxidantů referenční vzorek: trolox

11 10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 11 Metoda TRAP 2,2‘-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride 2,2‘-azobis(2-methylpropionamide) dihydrochloride

12 10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 12 Metoda TRAP v lipidové fázi 2,2‘-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)

13 10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 13 Metoda TRAP RN = NR N 2 + 2R * R 2, další reakce 2RO 2 * peroxylový radikál 2O 2

14 10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 14 Metoda TRAP 50% peak CL Čas Přidání vzorku 1/2 peak-time

15 10. 4. 2008Metody stanovení oxidativního stresu 15 Chemiluminescence Chemiluminiscence (2) aktivita MPO: bromid-dependentní chemiluminiscence v přítomnosti vzorku a peroxidu vodíku buněčná proliferace a cytotoxicita: luciferin-luciferáza závislé na ATP exprese genů reporter gene assay