Analytické metody Vladimíra Kvasnicová

SPEKTROFOTOMETRIE CHROMATOGRAFIE POTENCIOMETRIE VOLUMETRIE

Spektrofotometrie spektrofotometr

Materiál používaný pro analýzu: ROZTOK

PRINCIP interakce mezi stanovovaným analytem a monochromatickým zářením část záření je absorbována stanovovanou látkou, zbývající záření je detekováno detektorem množství absorbovaného záření je přímo úměrné množství analyzované látky

Spektrofotometrie je kvantitativní metoda: stanovujeme KONCENTRACI  koncentrace  tmavší roztok   absorpce

Důležité termíny vzorek = analyzovaný roztok neznámý vzorek = vzorek o neznámé koncentraci standard = vzorek o známé koncentraci blank = roztok neobsahující analyzovanou látku chromofor = část struktury chemické látky, která je schopna absorbovat záření určité vlnové délky

fialová 380 – 450 nm modrá 450 – 495 nm zelená 495 – 570 nm žlutá 570 – 590 nm oranžová 590 – 620 nm červená 620 – 750 nm viz. http://en.wikipedia.org/wiki/Electromagnetic_spectrum

Obrázek převzat z http://en. wikipedia

Používané elektromagnetické záření barevné vzorky: viditelné (VIS) bezbarvé vzorky: UV záření

A /  „absorpční spektrum“

Komplementární barvy

SCHÉMA spektrofotometru

Které veličiny jsou měřeny? TRANSMITANCE = poměr intenzity záření vystupujícího z kyvety (I) k intenzitě záření do kyvety vstupující (Io) (tj. záření dopadající na detektor / původní záření) T = I / Io T = 0 – 1 nebo v procentech % (0 – 100 %)

Jak se vyjadřuje množství pohlceného záření? veličina odvozená od transmitance: ABSORBANCE A = - log10 T = - log10 (I/I0) = log10 (I0/I) = log10 (1/T) A = 0 – 1.0 (1.5 nebo více) horní limit závisí na citlivosti detektoru

T prošlo (%) pohlceno (%) A 1 100 0.99 99 0.004 0.90 90 10 0.05 0.50 50 0.3 0.10 1.0 0.01 2.0 0.001 0.1 99.9 3.0 0.0001 99.99 4.0

 citlivosti detektoru prošlo (%) pohlceno (%) A 1 100 0.99 99 0.004 0.90 90 10 0.05 0.50 50 0.3 0.10 1.0 0.01 2.0 0.001 0.1 99.9 3.0 0.0001 99.99 4.0  citlivosti detektoru

Zjištění koncentrace: Lambert-Beerův zákon Kalibrační křivka Výpočet pomocí hodnot (A, c) standardních vzorků

Zjištění koncentrace: Lambert-Beerův zákon A =  x l x c nebo T = 10- ( x l x c) A = absorbance (A = -log T) T = transmitance (T = 10-A)  = molární absorpční („extinkční“) koeficient l = tloušťka kyvety (v cm), c = molární koncentrace

Kalibrační křivka 3 a více standardů zpracovaných stejnou metodou lineární kalibrační křivka A =  x l x c y = kx + q

Výpočet pomocí standardů Ast = cst x l x  Avz = cvz x l x  Ast / cst = l x  Avz / cvz = l x  l x  = l x  Ast / cst = Avz / cvz cvz = Avz x (cst / Ast) cvz = Avz x f f = průměr všech (cst / Ast) použitých při experimentu

Cvičení 1) Avz = 0,25 Cvz = ? Ast = 0,40 Cst = 4mg / L 2) standard glukózy: Cs = 1000mg/L, T = 0,49. neznámý vzorek: T = 0,55, Cvz = ? (v mg/L i mmol/L) MW = 180g 3) standard proteinů: T = 0,33; vzorek pacienta: T = 0,44 Porovnejte koncentraci proteinů ve vzorku pacienta se standardem.

absorpce ostatními látkami přítomnými ve vzorku musí být eliminována: Přesnost stanovení absorpce ostatními látkami přítomnými ve vzorku musí být eliminována: BLANK (slepý pokus) → jeho absorbance se odečte od absorbance vzorku  výsledná absorbance odpovídá pouze koncentraci analyzované látky

Spektrofotometrie v praktickém cvičení „Stanovení koncentrace kreatininu v moči“ analyzovaný vzorek: vlastní moč bezbarvý kreatinin je převeden na barevný produkt chemickou reakcí koncentrace kreatininu ve vzorku se zjišťuje z naměřené absorbance pomocí kalibrační křivky

Chromatografie chromatograf

Všechny chromatografické techniky nejsou instrumentální... TLC chromatografie = úkol v praktiku

PRINCIP Separace směsi různých látek je založena na rozdílné distribuci látek mezi dvě nemísitelné fáze: stacionární fáze (pevná nebo kapalná) mobilní fáze (kapalná nebo plynná) Mobilní fáze unáší jednotlivé vzorky skrz stacionární fázi rozdílnou rychlostí v závislosti na jejich afinitě k fázím.

pokud je „afinita“ látky k mobilní fázi vysoká, látka putuje systémem rychleji než látka s nižší afinitou pokud je „afinita“ látky ke stacionární fázi vysoká, látka je ve stacionární fázi déle zadržována a pohybuje se sytémem pomaleji než látka mající nižší afinitu

Obrázek převzat z http://www. chemistry. vt. edu/chem-ed/sep/lc/lc Obrázek převzat z http://www.chemistry.vt.edu/chem-ed/sep/lc/lc.html (listopad 2006)

Co je cílem analýzy? rozdělit (separovat) od sebe jednotlivé látky identifikovat látky (= kvalitativní analýza) stanovit koncentraci přítomných látek (= kvantitativní analýza)

Klasifikace chromatografických technik podle mobilní fáze kapalinová chromatografie (LC) plynová chromatografie (GC) podle uspořádání planární (rovinná) chromatografie chromatografie v koloně

kapalinová v koloně „manuální“ chromatografie

kapalinová v koloně „instrumentální“ chromatografie

příklad: kapalinová planární chromatografie

Plynová chromatografie (GC) Obrázek převzat z http://www.cofc.edu/~kinard/221LCHEM/ (listopad 2006)

podle fyzikálně-chemických interakcí adsorpční chromatografie rozdělovací chromatografie gelová permeační chromatografie (GPC) chromatografie na iontoměničních (IONEX) afinitní chromatografie

Fyzikálně-chemické mechanismy separace sítový efekt – gelová chromatografie adsorpce rozpouštění iontová výměna specifická interakce- afinitní chromatografie Snímek převzat z prezentace analyticke_metody / Petr Tůma

Obrázek převzat z http://fig. cox. miami Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)

Obrázek převzat z http://fig. cox. miami Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)

Obrázek převzat z http://fig. cox. miami Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)

Vyhodnocení chromatogramu 1) planární chromatografie (př. TLC) Porovnání skvrn se standardy: Rf = a /b Rf = retardační faktor („rate of flow“) a = vzdálenost start-střed skvrny b = vzdálenost start-čelo mobilní f. „b“ „a“ Obrázek převzat z http://sms.kaist.ac.kr/~jhkwak/gc/catofp/chromato/tlc/tlc.htm (listopad 2006)

2) chromatografie v koloně (HPLC, GC) Porovnání „píků“ se standardy: tR = retenční čas identifikace látek h = výška píku  koncentrace látek „píky“

Chromatografie v praktickém cvičení „ TLC lipofilních barviv“ = adsorpční planární kapalinová chromatografie mobilní fáze: toluen (nepolární) stacionární fáze: destička se silikagelem (polární) stadardy barviv → porovnání Rf neznámý vzorek: obsahuje 2 různá barviva

„Demonstrace HPLC a GC“ = High Performance Liquid Chromatography (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) normální nebo reverzní fáze princip (vysokoúčinná, vysokotlaká chromatogr.) GC = Gas Chromatography (plynová chromatografie)

Potenciometrie potenciometr

indikační (měřící) elektroda referentní (srovnávací) elektroda PRINCIP Potenciometrie je elektrochemická metoda založená na měření napětí elektrochemického článku za bezproudého stavu. dvě elektrody: indikační (měřící) elektroda referentní (srovnávací) elektroda

Schéma:

Elektrody indikační elektroda její potenciál závisí na složení roztoku referentní elektroda její potenciál je stabilní (konstantní, známý) Měřit přímo potenciál jako takový nelze  měříme rozdíl potenciálů (=napětí)

indikační elektrody Obrázek převzat z http://food.oregonstate.edu/images/ph/beck8.jpg (2006)

E = E0 + (RT/nF) ln aM Nernstova rovnice E = elektrodový potenciál E0 = standardní elektrodový potenciál R = molární plynová konstanta (8.314 J K-1 mol-1) F = Faradayova konstanta (96 458 C mol-1) T = absolutní teplota (25 0C = 298 K) n = náboj stanovovaného iontu (M) a = aktivita stanovovaného iontu

ln a = 2.303 log a; dosazeno za R, T a F  E = E0 + (RT/nF) ln aM ln a = 2.303 log a; dosazeno za R, T a F  E = E0 + (0.059/n) log aM ! DŮLEŽITÉ ! elektrodový potenciál závisí na teplotě roztoku, aktivitě („koncentraci“) a náboji stanovovaného iontu elektrodový potenciál nepotřebujeme počítat: ke kalibraci potenciometru používáme standardy

Obecná klasifikace elektrod elektrody I. druhu (kovové nebo plynové) elektrody II. druhu (kov + jeho nerozpustná sůl) → REFERENTNÍ ELEKTRODY redoxní elektrody (Pt, Au) membránové elektrody → ISE = iontově selektivní elektr. (stanovení iontů v medicíně: H+, Na+, K+, Cl-,...)

„Standardní vodíková elektroda“ (SHE) plynová elektroda její potenciál byl definován: ESHE = 0 za všech podmínek REFERENTNÍ ELEKTRODA, ale v praxi se běžně nepoužívá

Referentní elektrody kalomelová argent-chloridová SHE

„Skleněná elektroda“ = ISE (H+) stanovení pH membránová electroda

Membránové elektrody na stanovení plynů

elektroda používaná na stanovení CO2 v krvi

Potenciometrie v praktickém cvičení „ Měření pH fosfátového pufru“ roztoky fosfátového pufru o různém složení stanovení pH pomocí pH-metru (= upravený potenciometr) kalibrace přístroje pomocí standardů skleněná kombinovaná elektroda („dvojče“)

Skleněná kombinovaná elektroda

Skleněná kombinovaná elektroda v praktiku

Volumetrie (= titrace, odměrná analýza)

byreta s odměrným roztokem Metoda založená na chemické reakci mezi analyzovanou látkou a tzv. odměrným roztokem titrace = zjištění přesné koncentrace vzorku byreta s odměrným roztokem titrační baňka s naředěným analyzovaným vzorkem

PRINCIP K analyzované látce se pomocí byrety postupně přidává roztok o známé koncentraci, a to tak dlouho, dokud není dosaženo stechiometrického poměru reagujících látek (= bod ekvivalence) bod ekvivalence = reagující látky jsou ve stechiometrickém poměru daném chemickou rovnicí popisující probíhající reakci

Odměrný roztok (OR) známé, přesně definované složení jeho koncentraci lze přesně stanovit pomocí stadardu o známé a neměnné koncentraci reaguje se stanovovanou látkou rychle, bez vedlejších reakcí reakci lze popsat chemickou rovnicí v bodě ekvivalence dochází „skokem“ k fyzikálně-chemické změně, kterou je možno snadno indikovat

Zjištění přesné koncentrace OR titrací standardu o přesně známé koncentraci porovnání teoretické (předpokládané, vypočítané) spotřeby se skutečnou (aktuální, titrací zjištěnou): Vt / Va = f f = faktor odměrného roztoku (0,900 – 1,100) aktuální konc. OR (= titr): ca = f x ct faktorem při výpočtu koncentrace vzorku násobíme teoretickou hodnotu koncentrace OR

Výpočet koncentrace vzorku založen na znalosti stechiometrie chemické reakce a A + b B → c C + d D a, b, c, d = stechiometrické koeficienty = látkové množství (n) A = „odměrný roztok“, B = analyzovaná látka a / b = n(A) / n(B)

a / b = n(A) / n(B) a x cB x VB = b x cA x VA c = n / V → n = c x V c = molární koncentrace (mol/l) n = látkové množství (mol) V = objem roztoku a, b = stechiometrické koeficienty a x n(B) = b x n(A) a x cB x VB = b x cA x VA

jediná neznámá je koncentrace vzorku a x cB x VB = b x cA x VA známe stechiometrii chemické reakce známe koncentraci odměrného roztoku a jeho objem spotřebovaný při dosažení bodu ekvivalence známe objem vzorku použitého pro analýzu jediná neznámá je koncentrace vzorku cB

Cvičení 1) spotřeba odměrného roztoku: 23,8 ml NaOH, (f = 0,9685; C = 0,1M), vzorek = 10ml H2SO4; C = ? 2) spotřeba odměrného roztoku: 10ml KMnO4 (0,1M), vzorek: 20ml FeSO4 ; C = ? (mol/ L, % ), MW = 152g 3) H3PO4 → Na2HPO4 vzorek: 20ml H3PO4 (C = 0,3M ), odměrný roztok: 0,2M NaOH V = ?

Titraci provádí jedna osoba: po kapkách přidává OR z byrety za stálého promíchávání obsahu titrační baňky

Indikace bodu ekvivalence pomocí indikátoru jednoduché, ale subjektivní hodnocení bod ekvivalence  objemu OR po jehož přidání změní titrovaný roztok trvale své zbarvení indikuje „první nadbytečnou kapku“ přidaného OR  ve skutečnosti je při změně zbarvení roztok „přetitrován“ pomocí přístroje (např. potenciometru) objektivní vyhodnocuje se TITRAČNÍ KŘIVKA

Titrační křivka titrace kyseliny hydroxidem měřená veličina indikátory odměrný roztok

titrace hydroxidu kyselinou odměrný roztok

Klasifikace titrací neutralizační (acidobazické) kyselina /báze H+ + OH- → H2O oxidačně-redukční (redox) ox./red. činidlo oxidace: red → ox + e- redukce: ox → red + e- srážecí př. AgNO3 vznik nerozpustné sraženiny komplexometrické př. EDTA vznik koordinačně-kovalentní sloučeniny

Titrace v praktickém cvičení „Stanovení acidity žaludeční šťávy“ reaguje HCl ze žaludeční šťávy odměrný roztok: NaOH → neutralizační titrace (= alkalimetrie) indikátor: fenolftalein (bezbarvý → fialový) z konc. HCl se vypočítá pH žaludeční šťávy zjišťuje se pH před a po stimulaci (= na lačno a „po jídle“)

Návody na praktika + teorie metod: http://www.lf3.cuni.cz/chemie/ viz. Studium / praktika