Metodická základna molekulární patologie Michala Fiurášková, Jan Bouchal, Zdeněk Kolář Laboratoř molekulární patologie LF UP Olomouc http://lmp.upol.cz http://ustavpatologie.upol.cz

Molekulární metody genová úroveň nemoci přesné stanovení diagnózy infekční choroby onkologická onemocnění určení proliferační aktivity (imunohistochemické stanovení Ki67, PCNA) predispozice k chorobám-ateroskleróza, diabetes stanovení otcovství stanovení DNA ploidie - počítačová analýza, průtoková cytometrie) stanovení diferenciačních markerů (CD), onkoproteinů, onkofetálních antigenů (imunohistochemie, průtoková cytometrie) stanovení exprese receptorů pro růstové faktory (imunohistochemické: steroidní hormony, c-erbB-2…) somatické a germinální mutace

ÚVOD

Molekulární diagnostika Zásadní roli hrají: Monoklonální protilátky Hybridizace PCR (polymerázová řetězová reakce)

Monoklonální protilátky Imunohistochemie (téměř 200 protilátek na Ústavu patologie) Analýza proteinů v buněčných lyzátech (imunoblotting) ELISA test

afinita antigenu a specifické protilátky Imunohistochemie aplikace imunologických metod při studiu tkání nebo buněk afinita antigenu a specifické protilátky

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) „sandwich“ protilátka-antigen Kvantitativní analýza exprese proteinů Těhotenské testy Detekce infekčních agens

Western analýza=imunoblotting (proteiny) kDa 220 97 66 45 30 20 elektroforéza (polyakrylamidový gel) nitrocelulózová membrána prim, sek. protilátka chemiluminiscence p53 bandy Bcl-XL

Southern-Northern blotting (DNA, RNA) rozštěpení NK – restrikční endonukleáza elektroforéza detekce specifického fragmentu kapilárním přenosem a hybridizací

Metody založené na hybridizaci arteficiální spojení dvou vláken DNA komplementarita bází, DNA sonda (próba) ISH (in situ hybridizace) FISH (fluorescenční ISH) SKY (spektrální karyotypování) mFISH (multi color FISH) CGH – komparativní genomová hybridizace DNA čipy

FISH fluorescenční in situ hybridizace Možnost analýzy interfázních chromozomů (nevyžaduje kultivaci buněk a přípravu metafázických chromozomů) - Detekce polysomií, translokací, inverzí, delecí

SKY – spektrální karyotypování (spectral karyotyping) - počítačové zobrazení a analýza cytogenetické laboratoře identifikace početních i strukturálních chromozomálních aberací

high resolution banding mFISH Multi color FISH/ high resolution banding kombinace fluorochromů

CGH – komparativní genomová hybridizace (Comparative Genomic Hybridization) vizualizace chromozomových poruch hybridizace

DNA čipy (microarray) izolace DNA hybridizace počítačové zpracování Alterace DNA změněná exprese a aktivita proteinů DNA sekvence (array)

DNA čipy

DNA čipy - identifikace nových genů unikátní informace o změnách v expresi celého genomu v odpovědi na pokusný zásah nové diagnostické markery (BRCA1, BRCA2-adenokarcinom mléčné žlázy nebo ovaria)

PCR – polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction) detekce abnormální funkce genu (onkogeny, viry, bakterie, paraziti) enzymatická syntéza a amplifikace specifických sekvencí NK primer

Využití PCR - detekce libovolných mutací - identifikace virů, bakterií, buněčných parazitů - RT-PCR (reverzní transkriptáza) –pro detekci mRNA

3SR amplifikační reakce (self-sustained sequence replication) metoda detekující genové amplifikace využívá kolektivního účinku reverzní transkriptázy (např. z ptačího myeloblastového viru), RNázy H (z Escherichia coli) a T7 RNA polymerázy. přírodní replikační proces retrovirů realizovaný in vitro.

Přehled 1 Diagnostika Základní výzkum Terapie Monoklonální protilátky (IHCH, elisa, imunoblotting) Hybridizace (FISH, CGH, DNA čipy) PCR detekční koncovka (fluorescenční, radioaktivní, barevná) Základní výzkum Terapie

Základní výzkum Snaha o pochopení životních pochodů a možnosti jejich ovlivnění Může vycházet z dat získaných při klinické práci Buněčné kultury ovlivňování chemickými látkami cílené zásahy do vnitřního prostředí buněk (antisense RNA, transientní nebo stabilní transfekce = zavádění cizích genů do buněk) studium proliferace, apoptózy, jednotlivých i globálních změn exprese genů (DNA čipy, WB, IHCH)

Základní výzkum In vivo na zvířatech (výsadní postavení myší) athymické nahé myši pro studium nádorů knock-out/in myši (inaktivace/nový gen transgenní organismy) Průtoková cytometrie Tkáňová mikroarray Mikrodisekce mechanická laserová

Průtoková cytometrie technika umožňující kvantitativně analyzovat velké množství částic (např. buněk) v suspenzi cíleně separovat částice (buňky) splňující požadované parametry běžně užívané aplikace: detekce apoptózy analýza buněčného cyklu mnohobarevná imunofenotypizace buněčná proliferace

Tkáňová microarray (TMA) 1 parafinový blok – soubor různých tkání 0.2cm 0.06cm

Imunohistochemické barvení TMA Lung MB H&E MNF-116 (total keratin) barvení

Mechanická mikrodisekce separace buněk z tkáně

Laserová mikrodisekce (LCM)

Restrikční endonukleázy enzymy– vyštěpení určitých úseků DNA Molekulární klonování (plasmidy = extrachromozomální kruhové molekuly DNA - DNA knihovna (soubor sekvencí lidské DNA, DNA inzert) - cDNA knihovna (přepis mRNA) Sekvenování - lineární sekvence nukleotidů

Projekt HUGO (Human Genome Mapping Organization) složení lidského genomu 30-40 tisíc genů (jen 2x více než háďátko nebo octomilka) pouze 3-5% celého genomu jsou sekvence překládané do proteinů 95% genomu představují repetice-nekódující sekvence

Přehled 2 Diagnostika Základní výzkum Terapie Monoklonální protilátky Hybridizace PCR Základní výzkum Buněčné kultury + DNA manipulace Zvířecí modely Tkáňová mikroarray mikrodisekce Terapie

Terapie Získání léku na základě poznání biologického procesu, na základě screeningu chemických knihoven Klinické testy Genová terapie

Amplifikace HER2-NEU u nádorů prsu Imunohistochemické vyšetření + FISH Her2 = receptor z rodiny epidermálních růstových faktorů, gen amplifikován u 25-30% karcinomu mléčné žlázy Indikace léčby„herceptinem“ (blokace receptoru) Vyšetření 6 tis. x roční léčba 1 mil Kč (červeně HER2, modře centromera 17, zeleně TOPO2a)

Genová Terapie -Přenos genetického materiálu, jenž má léčebný účinek -Cílené vyřazení aberantního proteinu (např.onkogenu u rakoviny) Obnova exprese mutovaného genu u dědičných chorob Problém obranných mechanismů buňky k cizorodé DNA Problém selektivní terapie defektních buněk

Genová Terapie („antisense“ technologie) Antisense RNA – RNA komplementární k určité mRNA komplex translace umlčení genu

Shrnutí Diagnostika Monoklonální protilátky Hybridizace PCR Základní výzkum Buněčné kultury + DNA manipulace Zvířecí modely Tkáňová mikroarray mikrodisekce Terapie snaha o zacílení na molekulární úrovni