Metody imunodifuze a precipitace v gelech Jana Novotná

Imunoprecipitační reakce v gelech Dvojitá difúze ve dvou směrech

Antigeny, jejich vlastnosti a složení Imunogenicita - imunitní odpověď specificky namířená proti antigenu. Antigenní specifita – schopnost molekuly antigenu (nebo její části) reagovat se specifickou protilátkou. Antigenicita – dána povrchovou strukturou imunogenu – antigenními determinantami (ovalbumin, MH 42 000, má 5 antigenních determinant a thyroglobulin, MH 700 000, více než 40). Organismus reaguje jen na ty, které jsou mu cizí. Haptény – antigenní determinanty, samy o sobě neschopné vyvolat imunitní odpověď. Stanou se imunogenní navázané na bílkovinný nosič.

Antigeny, jejich vlastnosti a složení Chemické složení antigenů: bílkoviny polysacharidy lipopolysacharidy nukleoproteiny glykoproteiny steroidní hormony bakteriální a živočišné buňky, viry syntetické polypeptidy syntetické polymery

Protilátky (imunoglobuliny) a jejich složení Bílkoviny se specifickou vazebnou aktivitou vůči antigenu (antigenní determinantě), na jejichž podnět se vytvořily. Chemická povaha - imunoglobuliny

Protilátky (imunoglobuliny) a jejich složení Počet různých specifických protilátek - > 104. Imunoglobuliny - ~ 20% plasmatických bílkovin. Vazebné místo – 5% molekuly protilátky, rozlišuje velmi jemné rozdíly v antigenních determinantách. Struktura vazebného místa je přesně komplementární k antigenní determinantě (zámek a klíč), asi 3 aminokyselinové zbytky.

Protilátky (imunoglobuliny) a jejich složení Variabilita protilátek podmíněna 5ti třídami Ig: G, A, M, D, E Těžké řetězce – g, a, m, d, e Lehké řetězce – k, l Jejich podtřídami řetězců: IgG – g1, g2, g3, g4 IgA – a1, a2 IgM - m1, m2

Podstata vazeb antigen protilátka Síly elektrostatické - opačně nabité skupiny (-NH3+) – lysin, (-COO-) – k. asparagová) Vodíkové vazby (slabé reversibilní vodíkové můstky) Hydrofobní interakce (postranní řetězce nepolárních aminokyselin – Val, Leu, Ile, Phe) Van der Waalsovy síly (elektrony vnějších orbitů dvou makromolekul)

Afinita protilátky k2 Pl + Ag  PlAg k1 K = = [PlAg] k1 k2 [Pl] [Ag] Rovnovážná konstanta k2 [Pl] [Ag]

Imunoprecipitační reakce Slouží ke kvalitativní a kvantitativní detekci antigenů a protilátek: Fáze první – vznik primárních komplexů o nižší M.H. Fáze druhá – vzájemné propojení Ag a Pl do trojrozměrné mřížkovité struktury (vznik nerozpustných agregátů)

Poměr antigen/protilátka Prozóna : nadbytek Pl, nevytváří se precipitát (rozpustné imunokomplexy) Zóna ekvivalence- optimální poměr Ag/Pl - precipitát Post-zóna - nadbytek Ag (imunokomplexy se rozpadají)

Imunoprecipitační reakce v gelech Zakládají se na různé rychlosti difúze Ag a PL do gelu v závislosti na: jejich koncentraci fyzikálně chemických vlastnostech struktuře a vlastnostech gelu Nejužívanější gely – agar a agaróza

Imunoprecipitační reakce v gelech Jednoduchá difúze v jednom směru - difúze antigenu do gelu s protilátkou - difúze protilátky do gelu s antigenem

Imunoprecipitační reakce v gelech Dvojitá difúze ve dvou směrech (metoda Ouchterlonyho)

Imunoprecipitační reakce v gelech Dvojitá difúze ve dvou směrech

Imunoprecipitační reakce v gelech Kvantifikace: antigenu protilátky

Imunoprecipitační reakce v gelech Jednoduchá radiální difúze

Imunoprecipitační reakce v gelech Imunoelektroforéza – kombinuje separaci bílkovin ve směsi pomocí elektroforézy v agarovém gelu na jednotlivé frakce s imunodifúzí a precipitací. Plasma (směs antigenů) Elektroforéza Antisérum (směs protilátek) Imunodifúze

Imunoprecipitační reakce v gelech

Imunoprecipitační reakce v gelech Raketková imunoelektroforéza: Antigen pomocí elektroforézy migruje do gelu, který obsahuje protilátku. Výška raketky odpovídá koncentraci antigenu.