Cystická fibróza Autosomálně recesivní onemocnění (postiženi jsou homozygoti, heterozygoti jsou přenašeči) Frekvence přenašečů - etnická variabilita, 1 z 25 u jedinců severoevropského původu, postihuje obě pohlaví rovnoměrně CFTR – gen pro cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, lokalizován na 7 chromosomu Mutace v genu CFTR CFTR kóduje chloridový kanál, zodpovědný za transport chloridových iontů přes plasmatickou membránu epiteliáních buněk, které tvoří výstelku dýchacích cest, pankreatu a dalších tkání Porucha iontového transportu

Onemocnění závažná a chronicky progredující choroba porušená funkce CFTR vede k poškození plic (progresivní destrukce plic) v důsledku hromadění viskózního hlenu v plicích – obstrukce, opakované, chronické infekce (pneumonie, Pseudomonas, Cephacia), sekundární zánětlivý proces poškození plic zkracuje životnost na 30-40 let postižení trávicího traktu pankreatická sekrece - problémy s trávením (pankreatická insuficience - tuková a proteinová malabsorpce), porucha vylučovaní enzymů vedoucí k fibróze játra - jaterní léze, fokální biliární cirhóza střevní obstrukce, meconiový ileus – (15-20% novorozenců) postižení reprodukčního traktu - narušené formování vas deferens - sterilita zpětná resorpce solí v potních žlázách, zvýšený obsah soli v potu, nadbytečné ztráty solí, důsledek nefunkčního CFTR potních žláz

Příčina cystické fibrosy CFTR protein - cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cAMP regulovaný chloridový kanál transport Cl- přes plasmatickou membránu epiteliáních buněk (dýchací cesty, pankreas, další orgány) mutace v genu CFTR R NBD1 NBD2 TM1 TM2 Cl- TM- transmembránové domény lumen cytoplasma NBD-nucleotid vázající domény (ATP) R-regulační doména (cAMPdep.)

CFTR mutace Mutace delta F508 nejčastější alela (70% CF) Δ F508 alela má 3 nukleotidovou deleci delece aminokyseliny fenylalanin (F) v pozici 508 na aminokyselinové sekvenci chloridového transportéru 12 dalších častých mutací s frekvencí ~15% (celkem 1967 mutací http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/StatisticsPage.html) Kit pro reverzní hybridizaci (34 mutací) – záchyt pro českou populaci ~91%

Mutace CFTR genu mutace jsou germinální (ve všech buňkách jedince) somatické nebyly dosud popsány ancestrální povaha mutací - přenášeny z generace na generaci mutace de novo – velmi vzácně distribuce mutací je populačně specifická

Hemochromatóza autosomálně recesivní onemocnění, frekvence heterozygotů C282Y v ČR 1:15, neúplná penetrance hereditární hemochromatóza - relativně časté dědičné onemocnění charakterizované vstřebáváním nadbytku železa, jeho ukládáním v orgánech a z toho pak rezultujícím poškozením organismu hepatopatie, diabetes mellitus, arthropatie, impotence, amenorhea, kardiomyopatie, endokrinní poruchy sérové železo, saturace transferinu, sérový ferritin, jaterní biopsie venepunkční terapie, desferrioxamin

Mutace HFE genu

RFLP polymorfizmus délky restrikčních fragmentů restrikční analýza DNA pomocí jejího štěpení restrikčními endonukleázami (RE) ve specifických restrikčních místech pokud sekvenční diference (polymorfizmus) vytváří nebo ruší specifické místo pro RE, vznikají po restrikci fragmenty odlišných velikostí

RFLP polymorfizmus délky restrikčních fragmentů Restrikční endonukleázy (RE) známo asi 2100 bakteriálních RE RE rozpoznávají různě krátké sekvence nukleotidů (4,6,8),ve kterých pak štěpí kovalentní fosfodiesterové vazby Princip analýzy výchozí DNA (genomická DNA, PCR produkt) štěpení restrikčním enzymem na fragmenty různých velikostí elektroforetická separace fragmentů

Analýza mutace C282Y v genu pro hemochromatózu

Sekvence oblasti mutace C282Y 5´- TGGCAAGGGTAAACAGATCCctctcctcatccttcctctttcctgtcaagtgccctcctttggtgaaggtgacacatcatgtgacctcttca gtgaccacactacggtgtcgggccttgaactactacccccagaacatcaccatgaagtggctgaaggataagcagccaatggatgccaaggagttcgaac ctaaagacgtattgcccaatggggatgggacctaccagggctggataaccttggctGTACcccctggggaagagcagagatatacGTGCcaggtgg agcacccaggcctggatcagcccctcattgtgatctggggtatgtgactgatgagagccaggagctgagaaaatctattgggGGTTGAGAGGAGTGC CTGAGgaggtaattatggcagtgagatgaggatctgctctttgttagggggtgggctgagggtggcaatcaaaggctttaacttgctttttctgttttagagccctca ccgtctggcaccctagtcattggagtcatcagtgga – 3´ Primery místo GTAC štěpí restrikční endonukleáza RsaI místo mutace C282Y změna GTGC na GTAC

RFLP – mutace C282Y - ELFO

RFLP – mutace C282Y+H63D (hemochromatóza) MASTER MIX – na 1 vzorek 17 ul H2O 2 ul pufr 10 ul PCR produkt 1 ul restrikční endonukleáza (přidat na ledu) C282Y: restrikční endonukleáza RsaI H63D: restrikční endonukleáza BclI

Vyhodnocení gelové elektroforézy po restrikční analýze Mutace C282Y (v bp) Zdravý jedinec : 250 140 Homozygotní stav : 250 111 Heterozygotní stav : 250 140 111

Vyhodnocení gelové elektroforézy po restrikční analýze Mutace H63D (v bp) Nenaštěpená DNA: 208 Zdravý jedinec : 138 70 Homozygotní stav: 208 Heterozygotní stav: 208 138 70

Analýza mutace delta F508 v CFTR genu ASO-PCR: Obecný primer (O) Specifický primer bez mutace (N) Specifický primer nesoucí mutaci (M) M O Cílová sekvence N

PCR Mix 0 obsahuje primer obecný a „normální“ (N) PCR reakce probíhá ve dvou zkumavkách: PCR Mix 0 obsahuje primer obecný a „normální“ (N) PCR Mix 1 obsahuje primer obecný a „mutovaný“ (M) O/N O/M 1 2 Homozygot bez mutace Heterozygot přenašeč s mutací

ASO-PCR – mutace delF508 (cystická fibróza) PCR MASTER MIX – pro 1 vzorek PCR mix 1 voda 8,5 µl pufr 2,0 µl dNTP mix 4,0 µl MgCl2 2,0 µl primery M1 1,2 µl DNA 2,0 µl Taq polymeráza 0,4 µl (na ledu) PCR mix 0 voda 8,5 µl pufr 2,0 µl dNTP mix 4,0 µl MgCl2 2,0 µl primery M0 1,2 µl DNA 2,0 µl Taq polymeráza 0,4 µl (na ledu)

Vyhodnocení výsledků analýzy CFTR genu Detekce mutace ΔF508 podmiňující cystickou fibrózu Alelově specifická PCR + gelová elektroforéza M0 – PCR reakce detekuje alelu bez dané mutace M1 – PCR reakce detekuje alelu s mutací PCR produkt pro CFTR gen (ΔF508) PCR produkt pro kontrolní gen Nespotřebované PCR chemikálie (nemusí být vždy viditelné) M0 M1 zdravý homozygot homozygot s mutací heterozygot