Biochemie kardiovaskulárních onemocnění Karel Kotaška

Kardiální buňky

Normální stav Reverzibilní postižení buňky Nevratná ischemie

Svalová kontrakce v kardiomyocytu Zprostředkována klastrovými membránovými integriny ve spolupráci s přídavnými proteiny (dystrofinem) – proteinový komplex vazba proteinového komplexu na Z-disk sarkomery obsahující specifické proteiny (calsarcin 1, MLP a titin (titinová čepička – T-cap)) Tyto proteiny pak zprostředkovávají interakci integrinu s kontraktilními vlákny. Vazba Ca2+ na komplex cTn vyvolá konformační změnu cTn Uvolnění tropomyosinu a interakce aktinu s myozinem – svalová kontrakce - Regulační proteiny tenkých filament (TnI, TnT, TnC, MBP, tropomyosin a titin) jsou posttranslačně regulovány proteinkinázami a fosfatázami - PDE5 lokalizovaný v Z-disku reguluje lokální zásoby cGMP, a tím se podílí na aktivaci PKG a následné snížené senzitivitě myofilamentů k Ca2+ a tím k poklesu kontrakce. Při srdečním selhání hrají významnou roli posttranslační modifikace titinu.

Transport Ca během svalové kontrakce Vstup Ca2+ do kardioyocytu přes Ca2+ kanály stimuluje uvolnění Ca2+ ze sarkoplazmatického retikula prostřednictvím ryanodinových receptorů RYR2 vyvolá aktivaci myofilamentů v sarkomeře 2. Opětovné vstřebávání Ca2+ prostřednictvím SERCA2A pumpy regulované fosfolambanem (PLN). Ca2+ je z buněk eliminován také prostřednictvím (Na+)/Ca2+ pumpy. 3. Vazba AR agonistů na jejich receptory vyvolá aktivaci PAK s následnou fosforylací Ca2+ kanálů, RYR2, PLN a sarkomerových proteinů (cTn, myosin, MBP, titin) – relaxace a kontrakce svalů

Geny mutované při arytmiích Membránová depolarizace přes konnexinový kanál - aktivace Na+ pumpy Rychlá depolarizace – inhibice Na+ kanálu a otevření K+ a Ca2+ kanálů Ca2+ se váže na troponinový komplex a aktivuje kontraktilní aparát sarkomery 4. V důsledku transportu Ca2+ z cytosolu prostřednictvím Ca2+- pumpy v sarkoplazmatickém retikulu a iontovou výměnou Na+/Ca2+ s extracelulární tekutinou pak dochází k buněčné relaxaci. Vnitrobuněčná homeostáza Na+ je dosažena Na+/K+ pumpou. 5. Všechny molekulární komponenty vyžadované pro normální lektrofyziologickou aktivitu, kontrakci a adhezi zprostředkovanou desmozómy jsou vzájemně uspořádány tak, aby spolu mohly reagovat Geny mutované při arytmiích Geny mutované při kardiomyopatiích

Kardiovaskulární stres - stimulace – NO, NP, ATII - aktivace proteinů vázaných na Gq- a G11- receptory, neurotransmittery (katecholaminy) vázané na adrenergní receptory (-ARs)), cytokiny a růstové faktory. - Po vazbě na povrchově aktivní receptory je signál přenesen na proteinové kinázy aktivující další signální dráhy AC, adenylyl cyclase; AKAP1, PKA anchor protein 1; ANP, atrial natriuretic peptide; cAMP, cyclic AMP; DAG, diacylglycerol; FOXO, forkhead-box O proteins; HDAC, histone deacetylase; INPP5F, inositol polyphosphate-5-phosphatase F; InsP3, inositol-1,4,5-trisphosphate; JAK, Janus kinase; MAPK, mitogen-activated protein kinase; MEF2, myocyte enhancer factor 2; mRNA, messenger RNA; miRNA, microRNA; NFAT, nuclear factor of activated T cells; NKX2-5, NK2 transcription factor related, locus 5; NO, nitric oxide; pGC, particulate guanylyl cyclase; PICOT, PKC-interacting cousin of thioredoxin; PI(3)K-, phosphatidylinositol 3-OH-kinase-; PKA, cAMP-dependent protein kinase; PKC, protein kinase C; PDE5, phosphodiesterase 5; PKD, protein kinase D; PLC, phospholipase C; PtdIns(4,5)P2, phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate; PTEN, phosphatase and tensin homologue; RCAN1, regulator of calcineurin 1; ROCK, Rho-associated, coiled-coil-containing protein kinase; sGC, soluble guanylyl cyclase; SRF, serum response factor; STAT, signal transducer and activator of transcription.

Fyziologický metabolismus v myokardu

Energetický metabolismus srdečního svalu Srdce musí provést kolem 100 000 kontrakcí za den (při TF = 70/min). Tato činnost spotřebuje asi 15 % denního energetického výdeje těla. Denně se v srdci nasyntetizuje (recykluje) asi 6 kg ATP, tedy 20-30x více, než srdce samo váží. Srdce vyžaduje výlučně aerobní metabolismus, nemůže dlouhodobě pracovat na kyslíkový dluh. Dodávka kyslíku a živin do srdce proto probíhá efektivně jen během diastoly. Extrakce kyslíku v koronárním řečišti je jedna z nejvyšších v celém těle. Kardiomyocyty získávají ATP převážně oxidativní fosforylací. Energetickými substráty jsou: 1) Z 60-90 % mastné kyseliny a ketolátky 2) Z 10-40 % pyruvát: z toho 50 % z glukózy (vstupuje inzulin-dependentním GLUT 3), 50 % z laktátu (velmi efektivní spalování) V srdci se také nalézají určité zásoby glykogenu. V porovnání s kosterním svalstvem ale představují pouhých 20 %.

Patobiochemie myokardu Biochemické abnormality u patologických stavů myokardu - vedou k patologickým stavům jako srdeční selhání pro snížení srdečního minutového objemu, aterosklerózu věnčitých arterií, hypertenzi, kardiomyopatii, chlopenní vady; - jsou charakterizovány obecně depolarizací nebo relativním snížením práce srdečního svalu. Je přitom alterován: - energetický metabolismus Při akutním nebo chronickém nedostatku dodávky kyslíku a živin myokard selhává (snížení krátkodobé energetické zásoby ve formě kreatinfosfátu, snížení aktivity kreatinkinasy, která umožňuje kyvadlový přesun mezi kreatinfosfátem a ATP). - regulační proteiny Redukce aktivity myosinové ATPasy, způsobená změnami v expresi troponinu T nebo kinasy 2 lehkého řetězce myosinu; vede to ke snížení rychlosti interakce mezi myosinovými a aktinovými filamenty - spřažení excitace a kontrakce.

Patobiochemie myokardu U různých forem srdečního selhání je sníženo vypuzování Ca2+ z cytoplasmy do kontraktilního aparátu (sarkolema, T-tubuly, sarkoplasmatické retikulum). Dále se snižuje mRNA pro bílkoviny regulující pohyb Ca2+ mezi sarkoplasmatickým retikulem a cytoplasmou. Porucha exprese genů pro tyto proteiny má za následek porušení kontrakce i relaxace. V selhávajícím myokardu se snižuje potenciál vysokoenergetických fosfátů, klesá kapacita oxidační fosforylace v mitochondriích a dochází ke konverzi na fetální charakter glykolytického metabolismu; molekulové změny v kontraktilním aparátu zahrnují změny v profilu isoforem myosinu, stejně jako změny v cyklickém přesunu Ca2+ v průběhu diastoly a systoly.

Srdeční selhání – pokles aktivity PKA – zvýšená eliminace Ca2+, nadměrná fosforylace RYR2, zvýšená aktivace Gq/11 proteinu s následnou zvýšenou aktivitou PKC – blokování aktivity inhibitoru fosfatázy I a zvýšení aktivity fosfatázy I Pokles fosforylace PLN a inhibice svalové kontrakce v důsledku blokování vstřebávání Ca2+ sarkoplazmatickým retikulem - Zvýšená aktivita Gq/11-proteinu zvyšuje množství generovaného InsP3. InsP3 je vázán na specifické receptory v membráně sarkoplazmatického retikula a je stimulováno uvolnění Ca2+. InsP3 vstupuje do jater, kde vazbou na InsP3 receptor dochází k aktivaci jaderného kalmodulinu (CAMKII), čímž je aktivována PKD, a je fosforylován HDAC a dochází k významné transkripční regulaci. Zásoba buněčného Ca2+ aktivuje prostřednictvím CAMKII, i NFAT. Aktivované NFAT je pak transportováno do jater, kde se podílí na regulaci transkripce.

Hypertrofie myokardu Hypertrofie myokardu je kompenzační mechanismus (adaptace) způsobený přetížením. Trvale zvýšená srdeční práce navozuje zvětšení rozměru kardiomyocytu (přidání sarkomer a kontraktilního aparátu), takže kardiomyocyt se zvětší z normálních 15 mm na 25 mm (kardiomyocyty dospělých jedinců se nemohou dělit). Počáteční adaptační hypertrofie se při dalším přetěžování mění v patologický stav navozující selhávání srdeční činnosti. Dochází k reexpresi genů pro fetální isoformy kontraktilního aparátu, které nemají stejnou funkčnost jako isoformy dospělých.

Patobiochemie myokardu - podání pyruvátu zlepšuje kontraktilitu a cyklické přesuny Ca2+ v nemocném kardiomyocytu. Zdravý kardiomyocyt využívá jako hlavní zdroj energie b-oxidaci mastných kyselin; hypertrofický a selhávající myokard je ve větší míře závislý na využití energie ze sacharidů - z glukosy. - U hypertrofického, ale neselhávajícího myokardu je akcelerována glykolýza exogenní glukosy jako kompenzace snížené b-oxidace mastných kyselin. I přes tuto akceleraci glykolýzy, není aerobní oxidace glukosy zvýšena; dochází tak k nerovnováze mezi anaerobním a aerobním odbouráváním glukosy. - Některé látky zlepšují spřažení glykolýzy s oxidací glukosy v citrátovém cyklu, tím, že potencují oxidaxi glukosy aktivací pyruvátdehydrogenasového komplexu (PDC).

Patobiochemie myokardu Pyruvát a dichloracetát aktivují PDC přímo tím, že inhibují PDC-kinasu. Jiné působí nepřímo tím, že redukují b-oxidaci mastných kyselin buď inhibicí karnitin-palmitoyltransferasy 1 (kupř. etomoxir, oxfenicin) nebo mitochondriální b-oxidaci (kupř. trimetazidin, ranolazin). - Karnitin a jeho deriváty (propionyl-L-karnitin) nepřímo aktivují PDC snížením hodnoty poměru acetyl-CoA/CoA v mitochondriích. - Terapie i.v. glukosou s insulinem a K+ při akutním syndromu ischemie-reperfuze snižuje hladinu cirkulujících mastných kyselin a tím nepřímo aktivuje PDC. PDC=pyruvátdehydrogenasový komplex, CPT-1=karnitin-palmitoyltrnaferasa 1, TCA = cyklus citrátový, ETC=elektronový transportní systém

Metabolismus v myokardu při různých stavech

Akutní poškození myokardu Akutní hypoxie Kardiomyocyt je velmi citlivý na nedostek kyslíku. Hlavním důsledkem ischemie je velmi rychlá změna na anaerobní metabolismus, končící potenciálně toxickou mléčnou kyselinou; snižuje se rapidně zásoba energetických fosfátů (kreatinfosfát, ATP). Neschopnost kontraktility se objeví během 60 s. Změny v ultrastruktuře se objeví do několika minut (nabobtnání mitochondrií i celé buňky, deplece glykogenu). Tyto změny jsou z počátku reverzibilní, ale po 20-40 minutách trvající ischemie dojde k irreverzibilní nekróze postupně všech kardiomyocytů. Nekróza vede k vyplavení biochemických markerů (myoglobin, glykogenfosforylasa BB, vazebný protein mastných kyselin, troponin T, troponin I, kreatinkinasa-isoenzym MB, lehké i těžké řetězce myosinu, další enzymy - LD1, AST, CK). Nejprve jsou vyplaveny markery uložené volně v sarkoplasmě (myoglobin, část troponinu T), pak teprve vázané na buněčné struktury (větší část troponinu T a I, řetězce myosinu).

Časový sled klíčových změn v kardiomyocytech při akutní ischemii

Srdeční sval a ischemie Okluze koronární arterie  ischemie  výrazná změna struktury buněk, chemismu a jejich funkcí ztráta kontraktilní funkce arytmie smrt buněk Pokles poměru ATP/ADP, hromadění AMP, Pi, produkty metabolismu nejsou odstraňovány (laktát). Rychlý pokles kreatinfosfátu – kreatinkinasa + ADP → fosforylace ADP → ATP (jen krátkodobý mechanismus, nekompenzuje sníženou produkci ATP v mitochondriích)

Srdeční sval a ischemie Již mírná ischemie snižuje koncentraci ATP a kreatinfosfátu, zvyšuje hladinu anorganického fosfátu → aktivace glykolýzy (potřeba glukosy z krevního řečiště do srdečních buněk) → zvýšení koncentrace pyruvátu → přeměna LDH na laktát. Delší ischemie – hromadění substrátů (laktát, NADH+ a H+) → zpomalení glykolýzy na úrovni fosfofruktokinasy a glyceraldehyd-3-dehydrogenasy.

Srdeční dysfunkce

Srdeční dysfunkce je provázena nadměrnou aktivací neurohormonů (noradrenalin, renin, angiotensin II, endothelin, vasopresin), jejichž působením dochází k vazokonstrikci, retenci Na+ a vody -To přispívá k progresi srdeční dysfunkce a rozvoji srdečního selhání. - Organismus je však vybaven systémy, které jsou protiváhou nadměrné aktivace vazokonstrikčních hormonů; - jsou to endogenní vazodilatační systémy: natriuretické peptidy, oxid dusnatý a prostaglandiny. - Tyto systémy podporují diurézu, natriurézu a inhibují buněčný růst.

Regulační systémy

NP jako endogenní vazodilatační systémy

Srdeční dysfunkce

Natriuretické peptidy

Funkce NP

b-adrenergní signalizace Adrenergní agonisté stimulují srdeční činnost Vazba katecholaminů na sedminásobně zvlněné membránové receptory sdružené prostřednictvím G-proteinu s adenylátcyklasou zvyšuje nitrobuněčnou koncentraci cAMP a tím aktivuje proteinkinasu A (PKA). Vícestupňová b-adrenergní signalizace je naruššena v selhávajícím srdci

b-adrenergní signalizace Chronická aktivace sympatiku způsobuje trvalý vzestup katecholaminů v cirkulaci Snížená citlivost a downregulace srdečních beta-adrenergních receptorů, zvýšené koncentrace aldosteronu, vazopresinu a natriuretických peptidů, je zvýšena exprese kinázy b adrenergních receptorů PARADOX – podávání betablokátorů snižujících adrenergní signalizace vykazuje zlepšení srdečních funkcí a podporuje prevenci patologické remodelace u pacientů se srdečním selháním

Renin angiotenzin aldosteronový systém

Role reaktivních kyslíkových zbytků při dysfunkci myokardu

Role reaktivních kyslíkových zbytků při dysfunkci myokardu

Myoglobin Diagnostická kritéria Rozhodujícím parametrem je jeho negativní prediktivní hodnota (40 % za 1 hodinu po začátku onemocnění, 60 % za 2 hodiny, 90 % za 3 hodiny, 96 % za 4 hodiny). Nezvýšená hodnota myoglobinu mezi 2.-12. hodinou po začátku onemocnění s vysokou pravděpodobností vylučuje akutní infarkt myokardu. Zvýšená hodnota má být doplněna vyšetřením kardiospecifického markeru, v praxi dnes vyšetřením cTn. Negativní prediktivní hodnota vyšetření myoglobinu ( 60% za 3 hod. po začátku ischémie, 90% za 4 hod.) je významná v rozhodovacím postupu při vyloučení akutní koronární léze.

Kreatinkináza a izoenzymy Enzym cytosolu buněk příčně pruhovaného svalstva Katalyzuje přeměnu kreatininu na kreatinfosfát Při nekróze myokardu je celková CK zvýšena v odstupu 4-6 hodin po začátku ischemie Hladina celkové CK je nespecifickým ukazatelem poškození myokardu Závisí na věku, rase, pohlaví a svalové hmotě Omezený význam v diagnostice akutních koronárních syndromů Kreatinkináza – MB Hodnotíme buď enzymovou aktivitu (CK-MB) nebo hmotnostní koncentraci (CK-MBmass) Při stanovení hmotnostní koncentrace se detekují i částečně degradované molekuly, které ztratily enzymovou aktivitu ale zachovávají si vazbu na specifickou protilátku Specifický enzym pro myokard, v kosterním svalu se nachází pouze při jeho poškození Využívá se pro retrospektivní posouzení velikosti nekrotického ložiska. Hladina při nekrózách je zvýšena v odstupu 4-6 hodin po začátku ischemie, zvýšení přetrvává 24 – 36 hodin, normalizace do 5 dnů

Kreatinkináza a izoenzymy Vzhledem k časnému vzestupu i poklesu je možné stanovením CK-MB detekovat reinfarkt v časné fázi po prvním AIM.   Zvýšení CK MB v plazmě se může projevit u - postižení myokardu z různých příčin (akutní infarkt myokardu, myokarditida)     - muskulární dystrofie Duchennova typu     - maligní hypertermie     - polymyozitidy a dermatomyozitidy     - Reyova syndromu     - Vzácně u revmatoidní artritidy s vysokým titrem revmatoidního faktoru CK MB v plazmě není obvykle zvýšeno - u anginy pectoris, svalové zátěže, - myxedému (kde je zvýšení celkové CK cca v polovině případů), - intramuskulárních injekcí, - centrální mozkové příhody, perikarditidy, pneumonie, - plicní embolizace, epileptického záchvatu.

Isoenzymy kreatinkinázy Izoenzymy kreatinkinázy (CK) se vyskytují v řadě tkání. Subjednotky M (muscle) a B (brain) vytvářejí 3 izoenzymy cytosolové CK: CK MM - zastoupený v největší míře v kosterním svalstvu a myokardu, CK BB - vyskytující se převážně v mozku, hladkém svalstvu GIT a močového měchýře a CK MB - převážně v myokardu a kosterním svalu Tkáň Aktivita CK (U/g vlhké tkáně) CK MM (%) CK MB CK BB Kosterní svaly rychlá (bílá) vlákna pomalá (červená) vlákna 2500 – 3000   97 – 99 1 – 3 pod 0,1 95 5 Myokard normální patologicky alterovaný 500 – 700 70 – 80 20 – 30 Mozek 200 – 300 100 Gastrointestinální trakt 120 – 150 Močový měchýř 85 Děloha mimo graviditu 165 Děloha v graviditě 245 6 94 Placenta 250 19 1 80 Prostata Plíce 15 0 – 20 80 - 100

Isoenzymy kreatinkinázy V séru se vyskytují 4 izoformy CK-MB Akutní nekróza – poměr CK-MB2/CKMB1 >1,5 a hodnota CK-MB je >1 U/l, pak je vysoká specificita a senzitivita nálezu pro akutní infarkt myokardu Detekce izoforem je možná již 3 hodiny po začátku obtíží Negativní nález má vysokou prediktivní hodnotu pro nepřítomnost nekrózy Metody stanovení CK a izoenzymů CK – kreatinkinázová reakce CK-MB a CK-MB mass – sendvičová imunoanalýza, RIA, ELISA Izoenzymy - elektroforéza

Troponiny Troponiny strukturní bílkoviny buněk příčně pruhovaného svalstva. Troponin C - je vazebný protein pro vápníkový ion Troponin I - je kalcium-dependentní inhibitor interakce tenkých a tlustých myofilament - v nepřítomnosti vápníkových iontů blokuje vazebná místa mezi aktinem tenkých myofilament a myosinem tlustých myofilament. Troponin T - váže troponin C a I na tropomyosin.   Troponiny C, I a T tvoří s tropomyosinem troponin-tropomyosinový komplex který kontroluje kontrakci a relaxaci buněk příčně pruhovaného svalstva.

Troponiny Syntéza troponinů je kódována samostatnými geny Izoformy TnI   Izoformy TnI V myokardu dospělých osob je prokazatelná pouze jediná izoforma cTnI, která není ani za patologických okolností prokazatelná v kosterním svalstvu. Ve fetálním myokardu je – až přibližně do 20. týdne – prokazatelná pouze izoforma sTnIs, teprve později dochází k expresi a syntéze adolescentní izoformy cTnI; po porodu jsou v myokardu přítomné obě izoformy, až do přibližně 2. týdne života TnT 4 izoformy cTnT (cTnT 1-4) ve fetálním období liší se přítomností nebo naopak chyběním dvou rozdílných peptidických reziduí v primární struktuře

Troponiny Uvolňování troponinů (cTn) z kardiomyocytu do krve za fyziologických okolností prakticky nenastává. Obsah cTnT i cTnI je v kardiomyocytu ve srovnání s ostatními kardiomarkery významně vyšší. Troponin T Po vzniku ischemie se zvyšuje hladina TnT v séru za 4 – 6 hodin, zvýšení hladiny přetrvává 10 dnů až 2 týdny Troponin I Zvyšuje se asi 6 hodin po vzniku ischemie, zvýšení hladiny přetrvává 7 – 10 dní Není vhodný k diagnostice reinfarktu, ale přetrvávání jeho zvýšené hladiny umožní diagnostiku IM i při delším časovém odstupu mezi vznikem potíží a příchodem nemocného k vyšetření Metody stanovení kardiálních troponinů Kardiální troponin T – sendvičová imunometrická analýza Kardiální troponin I - sendvičová imunometrická analýza, ELISA

Dynamika kardiálních markerů při AIM