Dynamika exprese mRNA Sak, Polo kinázy 4, během růstu a zrání prasečího oocytu Autor: Milan Blaha Konzultant: Prof. MVDr. Jan Motlík, DrSc. Škola: Havlíčkovo gymnázium Havlíčkův Brod Pracoviště: Ústav živočišné fyziologie a genetiky Akademie věd České republiky Liběchov

Úvod Polo kinázy – důležité regulátory buněčného cyklu, mitózy, meiózy i diferenciace všech eukaryot charakteristické (krom Plk4) dvěma polo-boxy na C-konci. Plk4 obsahuje jen jeden polo-box a 3 PEST sekvence. První objevena v 80. letech 20. století u mutace polo Drosophily. Známe 4 Polo kinázy savců: Plk1, Plk2 (Snk), Plk3 (myší Fnk, lidská Prk), Plk4 (Sak, Stk18) Oocyt – neocenitelný model pro studium buněčného cyklu Prasečí model je v mnohém výhodnější než myší.

Plk4 (Sak) Dvě izoformy (Sak-a – 104 kDa, Sak-b – 53 kDa) – odlišná fukce. Protein i mRNA v proliferujících buňkách v S-G2-M, důležitá role v embryogenezi, indikátor proliferační aktivity. Nutná pro APC-dependentní ubiquitinaci cyklinu B1. Nadměrná exprese inhibuje buněčný růst, regulace funkce Sak-a je nezbytná pro korektní duplikaci centrozomů a regulaci mitotických struktur během buněčného dělení. Poruchy duplikace centrozomů byly zjištěny i u Plk4-/+ buněk a ukazují na možnou spojitost s p53. V lidských leukocytech je její exprese indukována Tec, která aktivuje c-Fos transkripční faktor. Inaktivace c-fos inhibuje růst buněk, ale mutace způsobuje růst nadměrný. AP-1 vazebný motiv je v promotoru sak.

Cíle Určení parciální sekvence cDNA pro Plk4 exprimovanou v prasečím oocytu a analýza této sekvence Zjištění dynamiky exprese mRNA pro Plk4 během růstu a zrání prasečího oocytu Efekt a-amanitinu na tuto expresi

Metody Izolace a kultivace oocytů, granulózních a kumulárních buněk Izolace totální RNA pomocí RNeasy Mini Kit® (QIAGEN) RT a PCR Molekulární klonování v plazmidických vektorech pomocí TA Cloning Kit® (Invitrogen) Izolace plazmidické DNA pomocí QIAGEN® Plasmid Midi Kit Sekvenace Sak-inzertu (BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit a sekvenátor ABI PRISM 310, AB) Kvantifikace množství mRNA pomocí jednokrokové Real-Time RT-PCR

Výsledky - analýza parciální sekvence prasečí Plk4 Po odfiltrování sekvencí vektoru a primerů navržených na myší sekvenci získáváme úsek cDNA, který kóduje tuto sekvenci 343 AA: Organismus Homologie Pes 78% Šimpanz 77% Člověk Kur 65% Myš 62% Drápatka 48% VEIQQNRLSLSSVLDHPFMSRNSSTKNKDLGTVEDSIDSGHATISTAITASSSTSICGSLFDRRKLLIDQPLPNKVTIFPKNKNSSDFTSSGDRSSFYTQWGNQEQETSNSGRGRIIQEAEERPHSRYLRRAHSSDRSGTSNQSRAKTYTMERCHSAEMLSKSKRSGVDENEEGYSPTNSNANIFNVFKEKTSSGSGSFEGPDNNQALSNHLCPGKTPFPFPDQTAQTEMVQQWFGNLQIHDPFSEQSKTRGTEPPLGYQKRTLRSITSPLTAYRLKPIRQKTKKAVVSILDSEEVCVELLKEFASQEYVKEVLQISSDGSMITIYYPNDGRGFPLADRPPSP Na lidské sekvenci se jedná o AA: 247-485 a 564-665 Konec kinázové domény PEST1 Sek. charakteristická pro Sak-a Začátek domény interagující s Tec a Sak kinázovou doménou

Výsledky – dynamika exprese Vzorek Poměr (objem) Poměr (oocyty) 1 1,000 2 1,255 2,452 3 0,469 1,584 4 0,452 1,526 5 0,420 1,416 Vzorky: 1 – rostoucí oocyty s průměrem 80 mm; 2 – rostoucí oocyty s průměrem 100 mm; 3 – FG oocyty (120 mm) v GV; 4 – FG oocyty (120 mm) v M-I; 5 – FG oocyty (120 mm) v M-II

Výsledky – efekt a-amanitinu a-amanitin – inhibitor exprese RNA, váže se na RNA-polymerázu II a III, čímž inhibuje jejich elongační krok. Byla užita koncetrace 10 ng/ml média. 1,000 1,384 0,885 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,200 1,400 1,600 1 2 3 Vzorek Poměr Vzorky: rostoucí oocyty s 80 mm v průměru bez kultivace v a-amanitinu rostoucí oocyty s 80 mm v průměru kultivované v a-amanitinu po dobu 8 hodin rostoucí oocyty s 80 mm v průměru kultivováné v a-amanitinu po dobu 20 hodin

Výsledky – efekt a-amanitinu na expresi referenčních genů Efekt stejné koncentrace (10 ng/ml kultivačního média) a-amanitinu byl zkoumán na prasečích kumulárních buňkách (PCC) na expresi b-aktinu a histonu 2A. 1,000 0,363 0,278 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,200 1 2 3 Vzorek Poměr b-aktin Histon 2A Vzorky: 1 – prasečí kumulární buňky (PCC ) bez kultivace v a-amanitinu; 2 – PCC kultivované v a-amanitinu po dobu 8 hodin, 3 – PCC kultivované v a-amanitinu po dobu 20 hodin

Diskuse Sak také pravděpodobně sehrává již dříve diskutovanou roli v APC dependentní degradaci cyklinu B. Stabilizovaný Sak transkript tvoří zásobu mRNA pro transkripčně neaktivní embryonální stádia. Efekt a-amanitinu se v oocytu zpožďuje díky jeho velikosti a intenzivní expresi Sak. Je třeba identifikovat Sak protein, jeho aktivitu během růstu a zrání oocytu, vztah k AP-1, c-Fos a APC.