Vyšetření mozkomíšního moku Mrázová K. Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1.LF UK

Co je mozkomíšní mok ? CSF nebo také likvor Tělní tekutina zajišťující: fyzikální ochranu mozku a míchy transport biomolekul v mozku odstraňování metabolitů (CO2,laktát) udržení konstantního nitrolebního tlaku obranu vůči patogenním mikroorganismům

Tvorba a cirkulace likvoru

Odběr likvoru Místo vpichu je na spojnici vrcholů kostí kyčelních a křížení s páteří v místě L4 Lumbální punkce

Indikace odběru CSF AKUTNÍ: SPECIÁLNÍ: Neuroinfekce Subarachnoidální krvácení Maligní infiltrace mening SPECIÁLNÍ: Chronická zánětlivá onemocnění CNS Purulentní meningitida

VZHLED NORMÁLNÍHO LIKVORU Před centrifugací Po centrifugaci Čirý, bezbarvý

LIKVOR SANGVINOLENTNÍ A XANTOCHROMNÍ

LIKVOR ZAKALENÝ

STATIM BIOCHEMIE Pandyho zkouška Celková bílkovina kvantitativně Laktát Glukóza (Chloridy) Spektrofotometrie

SPEKTROFOTOMETRIE

SPEKTROFOTOMETRIE 0,04 0,02 Absorbance Absorbance 415 nm Bilirubin Vlnová délka 415 nm 575 nm 540 nm Oxyhemoglobin 0,04 Absorbance Vlnová délka 450 - 460 nm Bilirubin 0,02 Normální nález

IMUNOCHEMICKÁ VYŠETŘENÍ Albumin Kvocient albuminu (CSF-alb/S-alb) Imunoglobuliny IgG, IgA, IgM Specifické proteiny CNS: MBP, NSE, S100 (β podjednotka) Transferrin Β-2-mikroglobulin CEA Stanovení oligoklonálních pásů IgG Volné lehké řetězce (kappa, lambda)

IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE

FUCHS-ROSENTHALOVA KOMŮRKA Pravidlo L

KOREKCE ELEMENTŮ Na 1000 ery odečítáme 1-2 elementy Příklad 1: 45 elementů 37 000 erytrocytů 45 - 37 = 8 (normální počet elementů) Příklad 2: 450 elementů 450 -37 = 413 (zmnožený počet elementů)

KOREKCE CELKOVÉ BÍLKOVINY Na 1000 erytrocytů odečítáme 0,003 g z celkové bílkoviny Příklad: CB v likvoru je 1,2 g/l erytrocytů je 250 000 1,2 - (250x0,003) = 1,2 - 0,75 = 0,45

Průtoková cytometrie

PŘÍPRAVA PREPARÁTŮ

Cytocentrifuga

BARVICÍ TECHNIKY MGG GRAM

Základní biochemické vyšetření likvoru Normální likvor Čirý, bezbarvý 0 arb.j. <0,45 g/l 2,2 - 4,2 mmol/l 1,1 - 2,1 mmol/l negativní Vzhled Pandy reakce Celková bílkovina Glukóza Laktát Spektrofotometrie

Základní cytologické vyšetření Normální likvor < 10 /3 Lymfocyty klidové 70% Monocyty klidové 30% Počet elementů Počet erytrocytů Kvalitativní cytologie Základní barvení (MGG) Barvení olejovou červení (lipofágy) Barvení dle Grama (bakterie) Berlínská modř (Fe3+v siderofázích) Další barvicí techniky

Ukázka normálního a patologického likvoru Normální nález: klidové lymfocyty monocyt Streptococcus pneumoniae

Základní biochemické vyšetření Albumin Imunoglobuliny Kvocient albuminu Q Alb = CSF-Alb x 10-3 S-Alb Výpočet lokální syntézy Imunoglobulinu Schema grafu dle Reibera 5 4 2 1 Q Alb Q Ig 3

Zkumavková ELISA

Princip ELISA metod Nepřímá kompetitivní ELISA Princip této metody je založen na tom, že antigen zakotvený na pevný nosič soutěží se stanovovaným antigenem ve vzorku o omezený počet vazebných míst na molekukách protilátky. Čím více antigenu obsahuje analyzovaný vzorek tím méně protilátky se naváže na zakotvený antigen. Nenavázané složky se odstraní a následně se přidá enzymem značená sekundární protilátka proti navázané protilátce. Konečná detekce je uskutečněna enzymovou reakcí, kdy vzniká barevný produkt. Intenzita zbarvení je měřena spektrofotometricky. Výhodou tohoto stanovení je možnost použití komerčně připravených značených protilátek (např. prasečí IgG proti králičím IgG). Přímá nekompetitivní ELISA - "sandwich" Nejčastěji využívané uspořádání enzymové imunoanalýzy na pevné fázi (ELISA) pro stanovení patogenů je přímý nekompetitivní (tzv. „sendvičový“) formát. V prvním kroku jsou na pevnou fázi imobilizovány protilátky. Poté je přidán antigen, který interaguje s navázanými protilátkami. Po odstranění nenavázaných složek následuje aplikace protilátky značené enzymem (nejčastěji peroxidasa, alkalická fosfatasa, b-galaktosidasa a glukosa oxidasa). K detekci je využita enzymová reakce, kdy je bezbarvý substrát přeměněn na barevný.

Destičková ELISA

Imunonefelometrie

Princip nefelometrie a turbidimetrie

Speciální vyšetření Oligoklonální IgG Bakteriologické vyšetření Specifické protilátky proti infekčním agens PCR Specifické proteiny CNS (S 100 β, NSE, MBP) Asialotransferin

Hnisavá neuroinfekce Elementy >900/3 Neutrofilní granulocyty Celková bílkovina >2 g/l Glukóza v CSF <40% S- glykemie Laktát > 3,5 mmol/l Neutrofilní pleocytosa

Nehnisavé neuroinfekce Elementy desítky až sta/3 Lymfocyty Celková bílkovina < 2 g/l nebo N Glukóza N Laktát < 3,5 mmol/l Lymfocytárná pleocytosa

Subarachnoidální krvácení Krvavý mok Po centrifugaci nažloutlý Spektrofotometrie: Oxyhemoglobin Bilirubin Fagocytované erytrocyty Celková bílkovina ↑─↑↑ Glukóza N─↓ Laktát ↑ Erytrosiderofág Siderofágy

Maligní infiltrace Elementy N - tisíce Maligní elementy Celková bílkovina N - ↑↑ Glukóza Laktát ↑↑ Maligní elementy

Chronické zánětlivé onemocnění – RS Elementy desítky-sta/3 Lymfocyt, plasmatické b. Celková bílkovina N nebo mírně ↑ Glukóza N Laktát N IEF 2 oligoklonální IgG Plasmatické b. a lymfocyty

ZÁVĚR Přehled likvorologické diagnostiky: Posouzení klinického stavu pacienta Další vyšetřovací metody : CT, MRI,... Základní vyšetření: biochemické a cytologické Speciální vyšetření: 1.IEF, specifické proteiny CNS ( S 100β, MBP, NSE) 2.mikrobiologické vyšetření protilátky proti infekčnímu agens, autoprotilátky 3.PCR

Děkuji za pozornost