Reprodukční genetika, preimplantační diagnostika 512 - Vývoj

Neplodnost Neplodnost, sterilita páru = neschopnost počít dítě během jednoho roku až dvou let pravidelného nechráněného pohlavního styku Infertilita (dysfertilita) žen neschopnost donosit a porodit životaschopné dítě při zachované schopnosti otěhotnět. Zdraví je fyzickým, duševním a společenským blahem. Bezdětnost znamená nemoc.

Neplodnost Primární – žena nebyla těhotná Sekundární neplodnost – ženy v minulosti těhotné byly Mnoho těhotenství zaniká ještě dříve, než je běžnými metodami můžeme prokázat - 50% všech vzniklých zygot se potrácí Neplodnost se týká 15-20% párů 33% porucha plodnosti muže 25% porucha plodnosti ženy 20% poruchy plodnosti obou v páru 15% neznámá příčina Nízká reprodukční schopnost, 15 až 20% pravděpodobnost, že otěhotní v průběhu jednoho měsíce, kdy dochází k pohlavnímu styku dvakrát týdně. Neplodný jen ten, který nevytvoří alespoň jednu spermii Neplodná je ta, která neprodukuje ani jedno oplození schopné vajíčko a není schopna donosit plod

Abnormality chromozómů způsobují 30% všech abortů, 60% časných abortů Autosomal monosomy Gardner, Sutherland: Chromosome abnormalities and genetic counseling, 1996

Trombofilní mutace způsobují infertilitu žen Mutace zvyšující riziko srážení – trombofilní mutace: Faktor V Leiden R506Q - AD, v genu pro hemokoagulační faktor V. nejčastější genetická porucha - 5% v evropské populaci. Heterozygoti mají riziko žilní trombózy 5−10 krát vyšší. U homozygotů je pravděpodobnost vyšší 80−100 krát. bodová mutace na 1q23. Faktor II Protrombin G20210A – zvýšená hladina protrombinu způsobuje 3 krát vyšší riziko vzniku trombózy oproti běžné populaci, frekvence heterozygotů 2-3%, mutace bílé rasy genu pro methylenetetrahydrofolát reduktásu MTHFR, na 1p36.3 , charakter AR chorob. Postižení mají zvýšené riziko vzniku vrozených vad neutrální trubice a poruchy srážlivosti.

Koagulační kaskáda

Příčiny neplodnosti - muži Genetické příčiny Kvantitavní či kvalitativní porucha spermatogeneze u 50% sterilních mužů Autoimunita k vlastním spermiím Epidymální blokáda chámovodů Koitální problémy Vazektomie Varikokéla - rozšíření žil v oblasti šourku Infekce chlamydií nebo kapavky

Vyšetřovací metody - muži Vyšetření moči, imunologické, hormonálních hladin, genetické vyšetření, psychologické vyšetření, biopsie nadvarlete/varlete Spermiogram – objem, viskozita, pH, koncentrace spermií: více než 20mil/ml – normospermik Motilita : rychle progresivně se pohybující………..a typ pomalé progresivně se pohybující………b typ neprogresivně pohyblivé…………………c typ nepohyblivé……………………………….d typ

Spermiogram morfologie spermií, kvantitativní hodnocení pohyblivosti, analýza dráhy a rychlosti Normozoospermie Oligozoospermie méně než 20mil/ml Asthenozoospermie méně než 50% a+b nebo méně než 25% a typu Teratozoospermie méně než 30% morfologicky normálních Azoospermie nepřítomnost spermií Aspermie nepřítomnost ejakulátu

Genetické příčiny – muži Aneuploidie ve 70% spermiích sterilních mužů – X, Y, 21, 8, 18 Aberace Marker chromozomy, Inverze, ringy, delece Y chromozomu Reciproké translokace Y – autozom Je prokázaný vyšší výskyt potratů u partnerky mužů s translokací.

Genové defekty Y chromozomu Azoospermia factor AZF (AZFa, AZFb, AZFc) geny v Yq12 a zčásti Yq11 postižené mutacemi, delecemi. Mikrodelece jsou příčina u 3,77% sterilních mužů, 15,63% azoospermických mužů. Genové mutace Cystická fibróza – většina (95%) mužů s CF je neplodných, vyskytuje se u 20% mužů s azoospermií

Klinefelterův syndrom Syndrom XYY – mohou být fertilní i sterilní Syndromy Klinefelterův syndrom Syndrom XYY – mohou být fertilní i sterilní Ženský pseudohermafroditismus – 46 XX, translokace chromozomu Y nebo jeho části (SRY) na jiný chromozom Mutace androgenních receptorů kompletní - testikulární feminizace u 40% s oligo a azoospermií inkompletní androgenní rezistence XR, hypospádie, kryptorchismus, mikropenis Kartagenerův syndrom AR – vzácné, poruchy motility spermií

hypospadia

Vyšetřovací metody - ženy Vyšetření průchodnosti vejcovodu, hormonální, imunologické, genetické, psychologické vyšetření Ovulace: měření progesteronu, bazální teploty, vyšetření vzorku endometria, ultrazvukové vyšetření Genetické: karyotyp, fluorescenční hybridizace in situ

Příčiny neplodnosti - ženy Genetické příčiny Ucpání či poškození vejcovodů Hormonální problémy Endometrióza - přítomnost sliznice dělohy v sousedních reprodukčních tkáních Příliš hustý cervikální hlen Imunologická rejekce spermatu Problémy s uhnízděním oplodněného vajíčka Předčasná menopauza

Genetické příčiny – ženy Turnerův syndrom – karyotyp 45 X0, delece X (Xp), 50% jsou mozaikové formy, většina je sterilní. S izochromozomem i(Xq) jsou fertilní Karyotyp 47, XXX - příčinou nondisjunkce v prvním meiotickém dělení Syndrom polycystických ovárií Kallmanův syndrom – snížená funkce žláz produkujících pohlavní hormony (chybění GnRH – hormon uvolňující gonadotropin)

Chromozomální aberace Aneuploidie, polyploidie, inverze, reciproké translokace Marker chromozomy, Mikrodeleční syndromy Porucha vývoje gonád – autozomální a X-vázané geny gonadální dysgeneze, hypogonadotropní hypogonadismus - hormonální příčiny - mutace genu působící nefunkčnost DAX1 proteinu (dosage-sensitive sex reversal)

Komplexní strukturní přestavba chromosomů 3, 8, 10 , balancovaný karyotyp matky

Microdeletion syndroms Current Protocols in Human Genetics Online Copyright © 2003 John Wiley & Sons, Inc.

Postkoitální test (Simsův-Huhnerův) = test životnosti spermií 6 - 24 hod po nechráněném styku se z děložního hrdla odebere vzorek hlenu Více než 6 dobře pohyblivých spermií je normální situace

Léčba neplodnosti Ženské - léčba poruch ovulace farmakologicky chirurgická léčba v oblasti vejcovodů Léčba endometriózy farmakologicky chirurgicky Mužské – změny spermiogramu – změna životního stylu, farmakologicky Léčba varikokély či uzávěru chirurgicky Léčba endokrinních či imunologických příčin

Asistovaná reprodukce IUI intrauterní inseminace IVF in vitro fertilizace ICSI intracytoplazmatická injekce spermie AH - asistovaný hatching ET – embryotransfer TESE - testikulární extrakce spermií MESA- mikroepidimální aspirace spermií PZD - parciální disekce zóny SUZI - subzonální inseminace - umístění 3 až 7 spermií do perivitelinního prostoru Kryokonzervace gamet, embryí Všechny metody při kterých dochází k manipulaci vajíček či spermií. Metody vycházející z postupů zavedených pro klasickou IVF Pokud v pořádku probíhá proces spermatogeneze (vývoj spermií), mohou být spermie odebrány z varlete pomocí metod TESE a TESA nebo z nadvarlete pomocí metod MESA a PESA.

TESE, MESA PZD SUZI ICSI

Embryotransfer

Přímá intraperitoneální inseminace DIPI Tubární transfer gamet GIFT- fertilizace ve vejcovodu s nutností laparoskopie, úspěšná, kde sterilita nemá tubární příčinu, zralé oocyty Tubární transfer oocytů s pozdější intrauterní inseminací (FREDI) – nezralé oocyty laparoskipicky, po určité době intrauterní inseminace Tubární transfer embryí EIFT – fertilizace in vitro, časná embrya (18 hod) transferována, páry s imunologickou a andrologickou příčinou Transvaginální tubární inseminace VITI inseminace pročištěnými spermiemi do ústí tuby Přímá intraperitoneální inseminace DIPI Intraperitoneální transfer oocytů a spermií POST Indikace v momentě, kdy byly odebrány jen nezralé oocyty, u lehce nezralých 8,5 hdiny, u jasně nezralých 19-20 hodin Ad4) absence jedné tuby, ovariální hypofunkce, cervikální faktor, idiopatikcá sterilita, Douglasův prostor: Slepý prostor v malé pánvi ohraničený zpředu dělohou, zezadu konečníkem a vystlaný pobřišnicí

IUI Vyvolání ovulace Získání a promytí spermií manžela či dárce a jejich přemístění do dělohy pomocí speciálního katetru Indikace: ženy s horm. poruchami, muži s neschopností ejakulovat do vaginy

In vitro fertilizace – IVF Farmakologická stimulace a odběr několika oocytů, kultivace v laboratorních podmínkách se spermiemi Transfer embrya do dělohy pacientky Indikace: poškození vejcovodů, endometrióza, problémy se spermiemi, neznámá příčina Gonadotropiny, transvaginální ultrazvuk, odběr oocytů 32-36 hodin po poslední hormonální injekci

Intracytoplazmatická injekce spermie - ICSI Farmakologická stimulace, mikromanipulatorní oplodnění spermiemi partnera, transfer embrya do dělohy Indikace: defekty spermií, oligoasthenospermie, azoospermie (po MESE, TESE), neúspěšný IVF

Asistovaný hatching Narušení zony pellucidy embrya mikromanipulační technikou pod mikroskopem, které přispívá ke zvýšení pravděpodobnosti nidace embrya v děložní sliznici Indikace: při neúspěšném otěhotnění, při mimotělním oplodnění nebo u žen nad 35 let Chemicky, mechanicky, pomocí laseru Kys tyrodová

Preimplantační genetická diagnostika - PGD Molekulárně - genetické, molekulárně - cytogenetické vyšetření gamet, polárních tělísek, blastomer, blastocyst Snižují se rizika spontánních potratů, zvyšuje se procento narození nepostiženého dítěte s genetickou zátěží. Zvýší se úspěšnost metod asistované reprodukce. Volba embryí nepostižených těžkými chormozománími aberacemi

Biopsie polárních tělísek Vyšetření oocytů Molekulárně genetické či cytogenetické - FISH Biopsie polárních tělísek Výhody: více času, bez rizika mozaicizmu Nevýhody: málo DNA, analýza pouze genomu matky, riziko crossing-overu, které vede k falešně poz i neg výsledkům, hlavně při biopsii prvního polárního tělíska

Biopsie blastomer Vyšetřeny 1-2 blastomery 2-3. den po fertilizaci in vitro z 6 -10 buněčného embrya Nevýhody: málo DNA, amplifikace informace jen jedné alely Výhody: 2 blastomery pro vyloučení mozaiky analýza genomu otce i matky U sterilních párů je nalézáno zvýšené zastoupení embryí s aneuploidiemi, mozaikami či chaotickým karyotypem

Biopsie blastocysty u plodných partnerů Výhody : analýza genomu otce i matky, analýza více buněk z trofoblastu, odběr 3-4 buněk 5. den po in vitro fertlilizaci Nevýhody: málo času na vyšetření Optimální kombinace vyšetření obou polárních tělísek s biopsií blastomer a s kontrolou závěrů prenatální diagnostikou ve II trimestru

Indikace - PCR versus FISH PCR: genové mutace u AD chorob, AR chorob, mutací mužských neplodností FISH : Identifikace pohlaví u X-vázaných dědičných chorob rodičovské translokací - reciproké, Robertsonské translokace a pericentrické inverze u jednoho z rodičů

Monogenní dědičné choroby: Familiární adenomatózní polypóza tlustého střeva - AD Deficience alpha-1-antitrypsinu - AR Cystická fibróza……………nejčastější Duchennova muskulární dystrofie - XR Syndrom fragilního chromozomu X - XR Hemofilie A,B - XR Huntingtonova chorea - AD Marfanův syndrom - AD Srpkovitá anémie - AR Tay-Sachsova choroba - AR Thalasémie …………středozemí

FISH MultiVysion (13,18,21,X,Y) (13,16,18,21,22) Z materiálu Dr. Jenčíkové - GENNET

Trisomie 13,18,21,X Z materiálu Dr. Jenčíkové - GENNET Multivision PB 9 chromozómů 13,16,18,21,22,X,Y,15,17 Z materiálu Dr. Jenčíkové - GENNET

Děkuji za pozornost http://www.advancedfertility.com/hatching.htm Human Genetics, Ricki Lewis, chapter 21: Reproductive technologies