Experiment: Test na přítomnost patogenu ve vodě z mytí brambor pomocí PCR
Vodu z mytí brambor použijeme k naočkování LB (Luria-Bertani) media. Další testy budeme provádět s izolovanými koloniemi, které se na tomto médiu objeví.
1. Extrakce DNA
1.1. Pipetujte 50μL sterilní destilované vody do sterilní mikrozkumavky (P1) Pozor! Suspenze musí být homogenní! 1.3.V mikrozkumavce (P1) rozmíchejte bakteriální materiál – vytvořte suspenzi 1.2.Kalibrovanou 1μL sterilní kličkou odeberte bakteriální kulturu
1.4.Inkubujte mikrozkumavku (P1) do vodní lázně při 100°C na 1 minutu Vložte mikrozkumavku (P1) do centrifugy Odstřeďujte mikrozkumavku (P1) po dobu 5 minut při 4500 otáčkách za min Vyjměte zkumavku a přeneste supernatant s DNA do další sterilní mikrozkumavky (P2).
2. Příprava směsi pro PCR (M)
2.1. Do sterilní mikrozkumavky pipetujte: 90 µL sterilní destilované vody 50 µL pufru 10X 28 µL MgCl2 25mM 28 µL dNTP 0,2µM 4 µL Taq polymerázy 2.2. Pokud PCR neprovádíte během dne přípravy směsi, je nutné směs zmrazit! 2.3. Před použitím rozmrazte a krátce odstřeďte. ! směs pro PCR je již připravena !
3. Amplifikace DNA
3.1. Do mikrozkumavky (A) pro PCR pipetujte 10µL roztoku DNA z mikrouzkumavky (P2) Přidejte 20µL PCR mix (M) Přidejte 10µL každého primeru metkRPECTO a metkFPECTO nebo 16SR a 16SF. Promíchejte svůj roztok opakovaným pipetováním a vypouštěním! Je možné použít oba páry primerů současně. Objemy primerů jsou potom 5μL.
3.4. Mikrozkumavku (A) krátce odstřeďte. 3.5.Vložte mikrozkumavku (A) do termocykleru. Poznačte si její umístění! T°C Nb cycles
3.6.Připravte dva kontrolní vzorky – zopakujte kroky 3.1. až 3.5., přitom nahraďte roztok DNA (P2): Vodou pro negativní kontrolu (C-) Roztokem DNA Pectobacterium atrosepticum pro pozitivní kontrolu (C+) Kontrola amplifikace DNA
5`, 72 °C dokončení 30``, 94 ° denaturace 40 cyklů 5`, 96°C denaturace 30``, 58°C navázání 30``, 72 °C elongace 3.7. Nastavte termocykler : 96°C, 5min 40 cyklů : 94°C, 30s 58°C, 30s 72°C, 50s 72°C 5min Skladujte při 4°C 3.8. Spusťte amplifikaci. T°C Nb cycles
4.Electroforéza fragmentů DNA
4.1. Do tří sterilních mikrozkumavek (E1, E2, E3), pipetujte 10μL roztoku PCR (A, C-, C +). 4.2.Přidejte 2μL nanášecího pufru (X) a zamíchejte.
4.3.Z gelové kazety odstraňte ochranný obal Vypláchněte jamky demineralizovanou vodou. Nakloňte kazetu – vylijte přebytečnou tekutinu a kazetu opatrně vysušte.
4.5.Do jamky pipetujte 5 µL testovaného roztoku E Do vedlejších dvou jamek potom 5 µL kontrolních roztoků E2 a E Do čtvrté jamky pipetujte 5µL roztoku molekulárních markerů (W)
4.8.Spusťte elektroforézu a nechejte ji probíhat po dobu 10 min při 220V. 4.9.Vypněte zařízení v okamžiku, kdy první proužky roztoku molekulárních markerů doputují na konec gelu.
5.Analyzujte vaše výsledky