Experiment: Test na přítomnost patogenu ve vodě z mytí brambor pomocí PCR.

Slides:



Advertisements
Podobné prezentace
Borrélie – úskalí laboratorní diagnostiky
Advertisements

Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA
Stanovení počtu vybraných indikátorových mikroorganismů v potravinách pomocí automatizované metody TEMPO® Mikrobiologie potravin, IV. ročník Ústav hygieny.
GENETICKÁ TRANSFORMACE BAKTERIÍ
Polymerázová řetězová reakce
Sterilizace je proces, který zabezpečuje usmrcení všech životaschopných mikroorganismů včetně spór.
PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C1.
Esterifikace Chemie Autor: Ing. Šárka Psíková
PCR. Polymerase chain reaction PCR Je technika, která umožňuje v krátkém času namnožit daný kus DNA bez pomoci buněk užívá se, pokud je DNA velmi malé.
Technika dávkování s elektronickou pipetou. Elektronická pipeta Elektronická pipeta s dobíjecím stojánkem.
DNA-Fingerprint1 Testování produktů elektroforézou v agarózovém gelu.
Izolace RNA z živočišné tkáně
Sterilizace Sterilizace je proces, který zabezpečuje usmrcení všech životaschopných mikroorganismů včetně spór.
Poškození DNA účinkem ionizujícího záření N. Stoklasová M. Caha G. Krejčíková M. Bulínová.
Praktické cvičení č. 3 ZÁKLADY GENOVÉHO INŽENÝRSTVÍ Klonování PCR produktu do vektoru PCR®2.1-TOPO® a transformace do E. coli AMOLc Úvod do molekulární.
Imunochromatografické stanovení přítomnosti antigenu RSV viru
(genové mutace, otcovství, příbuznost orgánů při transplantacích) RNA
Vyšetření citlivosti k antibiotikům
Genetická transformace bakterií II
Molekulární biotechnologie
Sekvenování.
Jak chránit DNA před zářením
Protokol č. Vyšetření slin na přítomnost antigenů krevních skupin
Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod:
F.I.S.H. hotovo.
Marie Černá, Markéta Čimburová, Marianna Romžová
Cystická fibróza Autosomálně recesivní onemocnění (postiženi jsou homozygoti, heterozygoti jsou přenašeči) Frekvence přenašečů - etnická variabilita,
Metoda SDA strand displacement amplification
OSMOTICKÁ FRAGILITA ERYTROCYTŮ.
Vývoj mikrosatelitních markerů (SSR) KBO/125 Jiří Košnar, katedra botaniky PřF JU, 2012 Kurz byl financován z projektu FRVŠ 1904/2012.
Analýza mutace C282Y v genu pro hemochromatózu
Kvantifikace nukleových kyselin
DNA diagnostika II..
Transformace 1 - KLONOVÁNÍ
Cystická fibrosa.
Stanovení původu kontaminace pacienta. Souvislosti Pacient nakažený infekcí byl po operaci hospitalizován. V průběhu hospitalizace absolvoval každý den.
Vyšetřovací metody v molekulární biologii
Antibiogram bakteriálního kmene
Sekvencování DNA stanovení pořadí nukleotidů v molekule DNA (primární struktury)
DNA diagnostika a principy základních metod molekulární biologie
Metodologie molekulární fylogeneze a taxonomie hmyzu
Proces bakteriální identifikace Část 1: Příprava API systému.
SEKVENOVÁNÍ DNA. Jedna z metod studia genů Využití v aplikovaných oblastech molekulární biologie – např. medicíně při diagnostice genetických chorob.
PRŮKAZ NUKLEOVÉ KYSELINY Lékařská mikrobiologie – cvičení, jarní semestr 2016 Mikrobiologický ústav LF MU
Immunoprecipitace Praktická práce – část I.. Protokol k experimentu Protokol.
Č.projektu : CZ.1.07/1.1.06/ Portál eVIM Fotosyntéza.
Zlepšování podmínek pro výuku technických oborů a řemesel Švehlovy střední školy polytechnické Prostějov registrační číslo : CZ.1.07/1.1.26/
Zjištění molekulární hmotnosti zeleně fluoreskujícího proteinu (GFP)
Environmentální aplikace molekulární biologie
Čištění GFP z lyzátu E.coli pomocí sloupcové chromatografie
qRT-PCR Kryostat Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D. Mgr. Martina Lánová RNDr. Josef Večeřa, Ph.D. Bc.
Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA
Imunochromatografické stanovení přítomnosti Helicobacter pylori ve stolici Cíl práce: Rychlý test pro kvalitativní detekci antigenu Helicobacter pylori.
OSMOTICKÁ FRAGILITA ERYTROCYTŮ.
Provedení DNA – otisků prstů
Imunochromatografické stanovení přítomnosti hemoglobinu ve stolici
NÁZEV ŠKOLY: ČÍSLO PROJEKTU: NÁZEV MATERIÁLU: TÉMA SADY: ROČNÍK:
RT – PCR: návrh primerů.
Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA
Izolace genomové DNA Základní kroky: Biologický materiál:
Výroba a degradace PLA 1.
Polymerase chain reaction Polymerázová řetězová rekce
SDS-PAGE Protokol experimentu
Rozložení nadpisu Podnadpis.
Praktikum z genetiky rostlin
Dominika verešová Kateřina Sapáková
1. Regulace genové exprese:
Rozložení obrázku s titulkem
URČENÍ BAKTÉRIE RODU BORRELIA POMOCÍ DNA SEKVENACE
Člověk a technika – TEPELNÉ STROJE
Transkript prezentace:

Experiment: Test na přítomnost patogenu ve vodě z mytí brambor pomocí PCR

Vodu z mytí brambor použijeme k naočkování LB (Luria-Bertani) media. Další testy budeme provádět s izolovanými koloniemi, které se na tomto médiu objeví.

1. Extrakce DNA

1.1. Pipetujte 50μL sterilní destilované vody do sterilní mikrozkumavky (P1) Pozor! Suspenze musí být homogenní! 1.3.V mikrozkumavce (P1) rozmíchejte bakteriální materiál – vytvořte suspenzi 1.2.Kalibrovanou 1μL sterilní kličkou odeberte bakteriální kulturu

1.4.Inkubujte mikrozkumavku (P1) do vodní lázně při 100°C na 1 minutu Vložte mikrozkumavku (P1) do centrifugy Odstřeďujte mikrozkumavku (P1) po dobu 5 minut při 4500 otáčkách za min Vyjměte zkumavku a přeneste supernatant s DNA do další sterilní mikrozkumavky (P2).

2. Příprava směsi pro PCR (M)

2.1. Do sterilní mikrozkumavky pipetujte: 90 µL sterilní destilované vody  50 µL pufru 10X  28 µL MgCl2 25mM  28 µL dNTP 0,2µM  4 µL Taq polymerázy 2.2. Pokud PCR neprovádíte během dne přípravy směsi, je nutné směs zmrazit! 2.3. Před použitím rozmrazte a krátce odstřeďte. ! směs pro PCR je již připravena !

3. Amplifikace DNA

3.1. Do mikrozkumavky (A) pro PCR pipetujte 10µL roztoku DNA z mikrouzkumavky (P2) Přidejte 20µL PCR mix (M) Přidejte 10µL každého primeru metkRPECTO a metkFPECTO nebo 16SR a 16SF. Promíchejte svůj roztok opakovaným pipetováním a vypouštěním! Je možné použít oba páry primerů současně. Objemy primerů jsou potom 5μL.

3.4. Mikrozkumavku (A) krátce odstřeďte. 3.5.Vložte mikrozkumavku (A) do termocykleru. Poznačte si její umístění! T°C Nb cycles

3.6.Připravte dva kontrolní vzorky – zopakujte kroky 3.1. až 3.5., přitom nahraďte roztok DNA (P2):  Vodou pro negativní kontrolu (C-)  Roztokem DNA Pectobacterium atrosepticum pro pozitivní kontrolu (C+) Kontrola amplifikace DNA

5`, 72 °C dokončení 30``, 94 ° denaturace 40 cyklů 5`, 96°C denaturace 30``, 58°C navázání 30``, 72 °C elongace 3.7. Nastavte termocykler : 96°C, 5min 40 cyklů : 94°C, 30s 58°C, 30s 72°C, 50s 72°C 5min Skladujte při 4°C 3.8. Spusťte amplifikaci. T°C Nb cycles

4.Electroforéza fragmentů DNA

4.1. Do tří sterilních mikrozkumavek (E1, E2, E3), pipetujte 10μL roztoku PCR (A, C-, C +). 4.2.Přidejte 2μL nanášecího pufru (X) a zamíchejte.

4.3.Z gelové kazety odstraňte ochranný obal Vypláchněte jamky demineralizovanou vodou. Nakloňte kazetu – vylijte přebytečnou tekutinu a kazetu opatrně vysušte.

4.5.Do jamky pipetujte 5 µL testovaného roztoku E Do vedlejších dvou jamek potom 5 µL kontrolních roztoků E2 a E Do čtvrté jamky pipetujte 5µL roztoku molekulárních markerů (W)

4.8.Spusťte elektroforézu a nechejte ji probíhat po dobu 10 min při 220V. 4.9.Vypněte zařízení v okamžiku, kdy první proužky roztoku molekulárních markerů doputují na konec gelu.

5.Analyzujte vaše výsledky