Mnohobuněčnost a diferenciace buněk Jana Fleischmannová

Vývoj mnohobuněčného organismu

Vývoj mnohobuněčného organismu 1. Dělení (cleavage) 2. Pattern formation - zajišťuje, že budou orgány založeny na správných místech 3. Organogeneze 4. Růst

Dělení Velmi rychlé dělení buněk, bez tvorby nové cytoplazmy Relativně velká zygota se dělí na mnoho mnohem menších buněk – blastomer Vzniká blastula

Gastrulace Reorganizace blastomer do dvou nebo tří zárodečných listů Entoderm Mesoderm Ektoderm

Gastrulace

Vznik tkání a orgánů Ectoderm: – Epidermis a její deriváty (vlasy, nehty), nervový systém Mesoderm: – svaly, kardiovaskulární soustava, kosti, krev, dermis, gonády, vylučovací soustava Endoderm: – trávící soustava, plíce, žlázy

Organogeneze Migrace a kombinace buněk z jednotlivých zárodečných listů Epitelio-mesenchymální interakce Kožní deriváty, trávící trakt, zuby, plíce

Embryologie Historie preformacionisté Buněčná teorie – Schleiden, Schwann Weismann barrier Germline cells contain information that passes to each generation unaffected by experience and independent of the somatic (body) cells.

Deskriptivní embryologie Cell fate mapping

Experimentální embryologie Spemannův organizer Spemann, Mangold Transplantace, recombinační experimenty, farmakologické ovlivnění vývojových procesů Xenopus laevis, kuřecí embryo, myš – explantátové kultury

Vývojová genetika Studium vlivu mutací na vývoj organismu Cílená mutageneze - homologická rekombinace Genetický skrýning Modelové organismy Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Danio rerio, Mus musculus

Základní buněčné procesy během vývoje Buněčná proliferace Buněčná specializace (diferenciace) Buněčné interakce Buněčný pohyb (migrace) Buněčná smrt (apoptóza)

Základní principy vzniku mnohobuněčnosti

Regulace těchto procesů probíhá na úrovni regulace transkripce Všechny buňky těla nesou stejnou genetickou informaci (genom) Základem diferenciace odlišnosti v genech, které jsou exprimovány

Regulace genové exprese Extracellulární faktory Růstové faktory, živiny, množství kyslíku, teplota Intracellulární faktory Změny struktury chromatinu Zpřístupnění nebo znepřístupnění genu pro transkripci

Regulace genové exprese Provozní (house-keeping) geny Exprimovány konstantně Nutné pro základní buněčné pochody Inducibilní geny Exprimované v přítomnosti specifických transkripčních faktorů

Regulace genové exprese Klíčová úloha transkripčních faktorů Vazba specifických úseků DNA a iniciace transkripce

Transkripční faktory DNA vazebná doména Oligomerizační doména Regulační doména: Aktivační Reprimační další

Zinkové prsty bZIP homeodoména bHLH

Transkripční faktory kontrolují vývoj homeoboxové geny

Homeoboxové geny Homeobox 180 bp obsahující DNA vazebnou homeodoménu Původně popsány u octomilky Pak objeveny savčí homology Mutace způsobují homeotickou trasformaci

Poruchy funkce homeoboxových genů Ultrabithorax (Ubx) určuje identitu halter Ubx mutant

Poruchy funkce transkripčních faktorů Spojeno s vývojovými defekty u člověka Synpolydactyly HOXD13 Hand-foot-genital syndrome HOXA11-13 Radioulnar synostosis HOXA11

Transkripce je regulována extracellulárními signály

Regulace transkripce genů změnou struktury chromatinu

Remodelace chromatinu Postranslační modifikace histonů „Histonový kód“ Acetylace metylace Ubikvitinace Fosforilace ATP-zavislá remodelace Acetylace typická pro transkripčně aktivní geny Deacetylace – inaktivace- gene silencing - umlčování

Enzymy účastnící se remodelace chromatinu Modifikátory histonů - nemění pozici nukleozomů Chromatin remodelační enzymy - hydrolýza ATP = aktivní remodelace - mění pozici nukleozomů, zpřístupňují nebo znepřístupňují regulační sekvence DNA - Multiproteinové komplexy

Remodelace chromatinu

Remodelace chromatinu

Vývojové defekty spojené remodelací chromatinu Rett syndrom - mutace v MeCP2 Rubinstein-Taybi syndrom - mutace v genu CREBBP - koactivátor transkripce

DNA metylace DNA metylace – přidání metylové skupiny k cytosinu DNA metyl transferázy Často v CpG opakováních CpG ostrůvky v promotorových oblastech genu Metylace brání vazbě transkripčních faktorů

Genomový imprinting U určitých genů je u potomka exprimována pouze alela pocházející buď od matky nebo od otce (IGF2) Poruchy imprintingu – dědičná onemocnění IGF2 – Wilmsův nádor pokud exprimován i z maternální alely Různé syndromy př. PraderWilli-Angelmann

Diferenciace buněk

Juxtacrinní laterální inhibice Vývojová signalizace Shh Wnt Parakrinní signalizace Laterální inhibice Notch/Delta Laterální inhibice Juxtacrinní laterální inhibice

Reciproční a laterální induktivní interakce Reciprocal inductive interactions involve cell populations that influence the development of each other Lateral inductive interactions involve signaling between developmentally equivalent cells

Embryonální indukce Signální centra produkují induktivní signály, na které reagují kompetentní okolní oblasti. Instruktivní: různé možnosti odpovědi - gradient morfogenu, apoziční indukce Permisivní: pouze jedna možná odpověď

Embryonální indukce Spemann, Mangold Spemannův organizer

Embryonální indukce

Reciproční epitelio-mesenchymální interakce

Laterální inhibice Notch-Delta signalizace

Molekulární signální dráhy

Molekulární signální dráhy TGFbeta Shh wnt Delta/Notch

Signální dráhy mezibuněčná komunikace během vývoje Opakované používání signálů „Add a pinch of BMP, sprinkle some Hedgehog, a touch of Wnt, and a handful of FGF and you can pattern an embryo, a limb, or an organ.“ (B.Z. Shilo, Cell, 2001)

Diferenciace buněk

Asymetrické dělení

Kmenové buňky

Vlastnosti kmenových buněk Totipotence, pluripotence, multipotence Asymetrické dělení Embryonální kmenové buňky odběr z blastocysty Výskyt i v dospělém organismu, zdrojem pro obnovu tkání „stem cell niches“

Zdroje embryonálních kmenových buněk z nepoužitých několikadenních lidských zárodků (skládá se z několika desítek buněk) z klinik pro umělé oplodnění terapeutické klonování (odběr buňky z pacienta → vložení do ženského vajíčka bez jádra → zárodek → blastocysta → z blastocysty se vyjmou kmenové buňky → kultivace kmenových buněk)

Zdroje embryonálních kmenových buněk

Etické aspekty Odběrem kmenových buněk dojde ke zničení embrya Otázka od kdy je lidská bytost V některých zemích zakázáno Francie, Švédsko, Itálie ČR povoleno použití nadbytečných embryí z asistované reprodukce Terapeutické klonování zakázáno

Dospělé kmenové buňky Překonání etických problémů s tvorbou embryí Kmenové buňky z pupečníkové krve, kostní dřeně i doalších orgánů mezenchymální kmenové buňky se získávají poměrně jednoduše odběrem žádané tkáně, např. punkcí kostní dřeně nebo odběrem tukové tkáně během operace. Po rozrušení mezibuněčných vazeb se mohou kmenové buňky vytřídit na přístrojích nebo se vloží do kultivačních nádob, kde se tyto buňky známé schopností adheze poměrně snadno přichytí a kultivují, zatímco ostatní zralé buňky se odmyjí

Zdroje dospělých kmenových buněk nika kmenových buněk – mikroprostředí, kde se nacházejí kmenové buňky, které s kmenovými buňkami interaguje a podílí se tak na regulaci jejich osudu. nika hematopoietických kmenových buněk – u obratlovců kostní dřeň tvořena subendoostealními osteoblasty, sinusoidálními endoteliálními buňkami a stromálními buňkami. nika kmenových buněk vlasového folikulu intestinální nika kmenových buněk Další – kmenové buňky ze zubní pulpy, z exfoliovaných mléčných zubů atd.

Nika kmenových buněk

Reprogramování diferencovaných buněk

Biomedicínské využití Zdroj náhradních diferencovaných buněk pro nefunkční tkáně, zdroj růstových faktorů pro regeneraci poškozené tkáně, genové terapie Léčba nádorů - hematopoetické kmenové buňky používané v klinické praxi pro léčbu některých leukémií, pro další nádory studie v různých stádiích Možná léčba imunodeficiencí V budoucnu naděje pro léčbu: roztroušená skleróza, diabetes, ochrnutí, infarkt myokardu, neorodegenerativní onemocnění

Orgánové náhrady Ex vivo vytvoření orgánů „na míru“ z vlastních kmenových buněk dárce Imunokompatibilita není riziko rejekce Komlexní souhra kmenových buněk biokompatibilních polymerových lešení a kokteilu vhodných diferenciačních faktorů

Udržování tkáňové homeostázy Nutná obnova tkání během celého života V různé míře neurony x epitel střevních klků Uplatnění shodnýchbuněčných procesů jako během vývoje Nutná rovnováha mezi proliferací – diferenciací – buněčnou smrtí = tkáňová homeostáza

Poruchy buněčných procesů Některé procesy spojené s embryonálním vývojem nejsou žádoucí během dospělého života Znakem nemoci př. migrace buněk při metastázách

Poruchy buněčných procesů Procesy nezbytné pro vývoj mohou být škodlivé v dospělosti teratomy

Poruchy buněčných procesů

Příliš mnoho buněk umírá AIDS Neurodenerativní onemocnění – Alzheimer – Parkinson Ischemické poškození Poškození jater způsobené toxiny – Alkohol

Proliferativní poruchy – rakovina

Protoonkogeny Růstové faktory a mitogeny Receptorové tyrosinové kinázy Cytoplasmatické receptorové kinázy Receptorové serin/threonin kinázy Regulační GTPázy Transkripční faktory Antiapoptotické geny

Aktivace protoonkogenů Gain-of-function dominantní mutace způsobující Zvýšení aktivity proteinu Ztrátu regulace negativní zpětnou vazbou zvýšení koncentrace proteinu zvýšenou expresí Zvýšení stability proteinu Genové amplifikace Chromosomální translokace Zvýšená exprese genu ve špatných buňkách nebo ve špatném čase Exprese konstitutivně aktivního hybridního proteinu Virové infekce Aktivace protoonkogenu silným virovým promotorem, aktivujícími regulačními sekvencemi V genomu začleněné virové onkogeny

Růstové faktory Proliferace za normálních okolností závislá na vnějších biochemických signálech – růstových faktorech Autokrinní stimulace proliferace Vede k nekontrolovatelnému buněčnému dělení nezávisle na signálech z okolí

Receptory růstových faktorů

Nádorové supresory Geny spojující buněčný cyklus poškození DNA Geny spojující poškození DNA s apoptózou Geny které se uplatňují při mezibuněčné adhezi, blokují ztrátu kontaktní inhibice a blokují tvorbu metastází Loss-of-function mutace, recesivní LOH – loss of heterozygozity I dědičné mutace

P53 - the guardian of the genome Mutován u více než 50 % nádorů Při poškození DNA hraje klíčovou úlohu v zastavení buněčného cyklu, opravě DNA a spuštění programované buněčné smrti v případě, že poškození nelze opravit, udržování genomové stability

p53

Vícestupňový proces Iniciace Promoce Progrese Vliv karcinogenů Genotoxické – poškození DNA Negenotoxické – podporují růst jiných mechanismem než je změna DNA, př. hormony

Proces karcinogeneze Hyperplasie Benigní nádor Maligní nádor Akumulace mutací Genomová nestability

Analogie s normálním vývojem Migrace – tvorba metastáz u maligních nádorů

Nádorové kmenové buňky Podobné vlastnosti jako normální kmenové buňky tumorigenicita – schopnost diferencovat do všech typů buněk daného nádoru Dávají vznik novým nádorům během procesu tvorby metastáz Mohou vést k relapsu onemocnění Terapie cílené na jejich odstranění

Děkuji za pozornost!