Sekvencování Sangerova metoda - dideoxyterminátory O PPP H OH H OH H H 5´ 3´ NTP N N N N NH 2 O PPP H H H OH H H 5´ 3´ dNTP N N N N NH 2 O PPP H H H H H H 5´ 3´ ddNTP N N N N NH 2
Dideoxyterminátory O PPP H H H H H H 5´ 3´ N N N N NH 2 FLU O PPP H H H H H H 5´ 3´ FLU O PPP H H H H H H 5´ 3´ FLU O PPP H H H H H H 5´ 3´ FLU N N N N O NH 2 N N O NH 2 N N O O CH 3
Průběh sekvencování 1. denaturace (92-96°C) 2. annealing (45-72°C) dsDNA 3. extenze (72°C)
Průběh sekvencování 1. denaturace (92-96°C) 2. annealing (45-72°C) dsDNA 3. extenze (72°C)
Průběh sekvencování 1. denaturace (92-96°C) 2. annealing (45-72°C) dsDNA 3. extenze (72°C)
Zařazování ddTTP ATGCTACGTTTAGCCACATTTGCCATATGAACCT TGCAAA O PPP H H H H H H 5´ 3´ FLU N N O O CH 3 TGCAAATCGGTGT TGCAAATCGGT TGCAAAT TGCAAATCGGTGTAAACGGT
Zařazování dalších ddNTP ATGCTACGTTTAGCCACATTTGCCATATGAACCT TGCAAA TGCAA TGCA TGCAAATCGGTGTA ATGCTACGTTTAGCCACATTTGCCATATGAACCT TGCAAATCC TGCAAATC TGC TGCAAATCGGTGTAAAC
Výsledek sekvencování TGCAAA TGCAA TGCA TGCAAATCGGTGTA TGCAAATCC TGCAAATC TGC TGCAAATCGGTGTAAAC TGCAAA TGCAAATCGGTGT TGCAAATCGGT TGCAAAT TGCAAATCGGTGTAAACGGT TGCAAATCG TGCAAATCGG TGCAAATCGGTG TGTG
Purifikace produktů Komerční souprava „DyeEx 2.0 Spin Kit“ pryskyřice odstraní dideoxyterminátory odstraní anorganické zbytky reakce
Kapilární elektroforéza Genetic Analyzer 3130 Applied Biosystems rozdělí produkty sekvencování podle velikosti detekuje fluorofory laserem