BIOCHEMIE SIGNÁLNÍCH LÁTEK CYTOKINY A METABOLIZMUS EIKOSANOIDŮ Jana Švarcová

Eikosanoidy  sloučeniny odvozené od polyenových nenasycených mastných kyselin obsahující 20 uhlíkatý řetězec  patří sem:  prostaglandiny  prostacykliny  tromboxany  leukotrieny  lipoxiny  hydroxyeikosatetraenové kyseliny (HETE)  hepoxiliny prostanoidy

Funkce eikosanoidů  Eikosanoidy - vnitrobuněčné signalizační molekuly - jsou považovány za lokální hormony působící poblíž místa svého vzniku prostřednictvím membránových receptorů  autokrinně – regulační efekt na buňku zdrojovou  parakrinně – působení pouze na sousední buňky  dle svého charakteru ovlivňují – svalovou kontrakci, krevní tlak, dýchání, činnost střev či dělohy, srážení krve (agregace trombů); imunitní systém – zánětlivé reakce → bolest, otok, horečka

Podle metabolických přeměn vznikají různé eikosanoidy → různé funkce *NSA – nesteroidní protizánětlivá léčiva (nonsteroidal anti-inflammatory drugs)

Biosyntéza eikosanoidů  V metabolismu nenasycených mastných kyselin (PUFAs), především linolové a arachidonové

kyselina arachidonová  nenasycená mastná kyselina - 4 dvojné vazby = tetraenové kyseliny; série ω 6  důležitá složka fosfolipidů u živočichů  do těla se dostává jednak potravou (rostlinné oleje, arašídy, sója, kukuřice), jednak vzniká z esenciální nenasycené mastné kyseliny linolové ( ω 6) a linolenové ( ω 3)  prekurzor pro syntézu eikosanoidů  arachidonát pro jejich syntézu je uvolněn z buněčné membrány působením fosfolipázy A 2 (nebo fosfolipáza C)

Uvolňování kys. arachidonové z buněčné membrány  PLC – hydrolyzuje fosforylovaný inozitol (z inozitol fosfátů)  PLA 2 – specifická pro fosfoacylglyceroly arachidonová kys. – připojuje se na glycerol

∆ 6 – DESATURÁZA Mikrozomální systém prodlužující řetězec (ELONGÁZA) ∆ 5 – DESATURÁZA Konverze linoleátu na arachidonát  kys. arachidonová je (u lidí) syntetizována z kys. linolové !!! NELZE syntéza de novo  esterifikace fosfolipidů lipidové dvojvrstvy plazmat. membrán

Konverze kyseliny arachidonové na prostaglandiny a tromboxany Membránové fosfolipidy Arachidonát Prostaglandiny (PT) a tromboxany (TX) Leukotrieny (LT) Fosfolipáza A 2 Různé stimuly, např. angiotensin II, bradykinin, adrenalin, trombin Protizánětlivé kortikosteroidy – inhibice syntézy všech eikosanoidů inhibicí fosfolipázy A 2 (inhibiční protein lipokortin) Lipogenáza aspirin, indometacin - inhibují pouze cyklooxygenázu Cyklooxygenáza ⊕ ⊝ ⊝ lipoxygenázová dráha - lineární cyklooxygenázová dráha – cyklizační (vznik prostanoidů)

Hlavní místa produkce eikosanoidů  endoteliální buňky  leukocyty  destičky  ledviny  Na rozdíl od histaminu nejsou eikosanoidy syntetizovány předem a uskladněny v granulech, ale v případě potřeby jsou velmi rychle produkovány z uvolňovaného arachidonátu  Biosyntéza eikosanoidů může probíhat ve všech typech buněk kromě červených krvinek  Každá buňka vykazuje přítomnost různých enzymů, které metabolizují arachidonát do podoby různých eikosanoidů

Hlavní kroky vzniku eikosanoidů 1) Aktivace fosfolipasy A 2 (PLA2) 2)Uvolnění arachidonátu do cytosolu z membránových fosfolipidů působením PLA2 3) Syntéza eikosanoidů z arachidonátu COX nebo LO dráha + další úpravy syntázami/izomerázami (přeměna PGH 2 na další prostanoidy, přeměna LTA 4 …) v závislosti na typu buněk

 PLA 2 je aktivována ↑ intracelulární koncentrací Ca 2+, stimulující roli hraje fosforylace PLA 2 Vazba ligandu na receptor → aktivace fosfolipázy C: PIP 2 → DAG + IP 3, který otevírá kanály pro Ca 2+ v ER. Účinkem Ca 2+ a fosforylace (=aktivace) (MAPK, CAMKII) translokuje PLA 2 k membránám GK, ER a/nebo jádra, z nichž uvolňuje arachidonát pro zde se vyskytující enzymy COX / LO.  cPLA 2 (cytozolická PLA 2 ) – důležitá úloha při uvolňování kys. arachidonové – farmakologicky – cíl pro protizánětlivá léčiva; cílená inhibice PLA 2 však problematická – velký počet enzymů typu PLA 2 (člověk – 19 druhů) Aktivace fosfolipázy A 2 Ca GK, ER, nebo nukleární membrána translokace aktivace NOS syntéza/ aktivace plasma membrána Ligand: např. ATP uvolňované umírajícími buňkami (protein- kináza C) prostaglandiny arachidonová kyselina (fosfolipáza C)

 Expresi / aktivitu PLA 2 stimulují:  interleukin-1  angiotenzin II  bradykinin  trombin  adrenalin…  Expresi / aktivitu PLA 2 blokují:  dexametazon (syntetický adrenokortikální steroid)  annexin 1 (lipokortin) – protein indukovatelný glukokortikoidy  kaspasa-3 dexametazon

Mobilizace arachidonátu pro syntézu eikosanoidů  Z membránových fosfolipidů, především působením fosfolipázy A 2 : Uvolnění arachidonát u z fosfolipidů blokují protizánětlivé steroidy!

 3 dráhy:  cyklooxygenázová – vede ke vzniku prostaglandinů a tromboxanů  lipoxygenázová – vede ke vzniku leukotrienů, lipoxinů, hepoxilinů a 12- a 15-HETE (hydroxyeikosatetraenové kys.)  enzymy cytochromu P450 (monooxygenázy) – vede ke vzniku dalších HETE, mj. 20-HETE; v proximálních tubulech ledvin je to hlavní dráha Biosyntéza eikosanoidů

Cyklooxygenázová dráha (COX)  Prostaglandin H-syntháza, která existuje ve 2 izoformách (PGHS-1/COX-1, PGHS-2/COX-2) a má dvě různé aktivity:  cyklooxygenázovou (COX) – katalyzuje adici dvou molekul O 2 do molekuly arachidonátu za vzniku PGG 2  hydroperoxidázovou – katalyzuje přeměnu hydroperoxyskupiny PGG 2 na hydroxyskupinu PGH 2 ; využívá glutathion  Je schopna autoinaktivace !!!  Daný typ buňky produkuje jen jeden konkrétní druh prostanoidu: destičky produkují téměř výhradně tromboxany, vaskulární endoteliální buňky především prostacykliny, buňky myokardu hlavně PGI 2, PGE 2, PGF 2 

Prostaglandin H-syntáza vzniká cyklický endoperoxid (9,11) & 15-hydroperoxid PGH 2 – prekursor tromboxanů a dalších prostaglandinů skupiny 2 !!!

Produkty COX dráhy  Destičky obsahují tromboxansyntázu, která řídí syntézu tromboxanů  Endoteliální buňky cév obsahují prostacyklinsyntázu, která katalyzuje vznik prostacyklinů (PGI 2 ) šestičlenný kruh obsahující jeden atom kyslíku (tromboxan) ( prostacyklin ) cyklopentanový kruh

Inhibice COX dráhy  aspirin inhibuje COX aktivitu PGHS-1 i PGHS-2 (acetylací serinu enzymu)  I další nesteroidní protizánětlivá léčiva inhibují COX aktivitu (ibuprofen – kompetuje s arachidonátem)  Transkripci PGHS-2 blokují protizánětlivé kortikosteroidy

Lipooxygenázová dráha  3 různé lipoxygenázy zavádějí kyslík do polohy 5, 12 či 15 arachidonátu; prvním produktem je hydroperoxy- eikosatetraenová kyselina (HPETE)  Pouze 5-lipoxygenáza tvoří leukotrieny; pro aktivaci vyžaduje protein FLAP Gly-Cys- γ Glu S -Glu leukotrien D 4 leukotrien E 4 -Gly peptidoleukotrieny hepoxiliny (HXA 3 ) konjugované trihydroxytetraeny 15-lipoxygenáza 5-lipoxygenáza 15-lipoxygenáza 12-lipoxygenáza

Syntéza peptidoleukotrienů Vyžaduje glutathion!!!

Syntéza eikosanoidů enzymy CYP450  enzymy cytochromu P450 – monooxygenázy: RH + O 2 + NADPH + H +  ROH + H 2 O + NADP +  vznikají dva hlavní typy sloučenin:  epoxygenázy katalyzují vznik epoxyeikosatrienových kyselin (EETs), které jsou epoxidhydrolázami metabolizovány na téměř neaktivní dihydroxyeikosatrienové kys. (DiHETEs)  hydroxylázy katalyzují vznik HETEs, např.  -hydroxyláza katalyzuje vznik 20-hydroxyeikosatetraenové kys. (20-HETE); (dále 13-HETE, 10- HETE, …)

Celkový přehled produktů arachidonová kyselina CYP450 DiHETEs 19-, 20-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 15-, 16-, 17-, 18-HETE cyklooxygenázy prostacykliny prostaglandiny tromboxany lipoxygenázy 5-, 8-, 12-, 15-HETE lipoxiny hepoxiliny leukotrieny EETs

Protizánětlivé působení kortikosteroidů

Biologické účinky eikosanoidů  Eikosanoidy účinkují už ve velmi nízkých koncentracích (jako hormony)  Mají krátký poločas, působí tedy na autokrinní a parakrinní úrovni (na rozdíl od hormonů)  Účinky v organismu se liší nejen podle druhu eikosanoidu, ale i podle toho, na které receptory může v daném místě působit

 Zprostředkovávají zánětlivou odpověď, zvláště v případě kloubů (revmatická artritida), kůže (psoriáza) a očí  Účastní se vzniku bolesti a horečky  Participují na regulaci krevního tlaku  Účastní se regulace koagulace  Ovlivňují činnost ledvin  Podílí se na kontrole některých dějů rozmnožovacího procesu (např. navození porodu) Biologické účinky eikosanoidů - obecně

Působení prostanoidů  Přes receptory spřažené s G-proteiny:  a) G  s proteiny aktivují adenylátcyklázu (AC), tj. tvorbu cAMP, které aktivuje proteinkinázu A (PKA)  b) G  i adenylátcyklázu inhibují (např. PKA)

 c) G q aktivuje fosfolipázu C (vyžaduje též přítomnost Ca 2+ ), která štěpí fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát (PIP 2 ) za vzniku inositol-1,4,5- trisfosfátu (IP 3 ) a diacylglycerolu (DAG); DAG spolu s Ca 2+ aktivuje proteinkinázu C, IP 3 otevírá kanály pro Ca 2+ v ER Působení prostanoidů +

Biologické funkce prostaglandinů  Mediátory zánětu – způsobují:  vasodilataci  zarudnutí, horkost (PGE 1, PGE 2 )  zvýšení permeability cév  otok  Ovlivňují bolest a horečku: PGE 2 potencuje intenzitu a trvání bolesti, kterou vyvolávají histamin a bradykinin  PGE 2, PGF 2 vyvolávají porod  Prostaglandiny řady PGE inhibují žaludeční sekreci (syntetické analogy se užívají při léčbě peptických vředů)  Regulace krevního tlaku: vazodilatační PGE, PGA a PGI 2 snižují systémový arteriální tlak

Biologické funkce prostanoidů  ovlivnění agregace destiček – antagonisté TX / PGI 2  tromboxany (TX) - syntetizovány v krevních destičkách a po uvolnění vyvolávají vasokonstrikci (TXA 2 ) a agregaci destiček  prostacykliny (PGI 2 ) – produkovány endoteliálními buňkami cév a inhibují agregaci  grónští Eskymáci – nízký výskyt srdečních chorob, snížená agregace destiček a prodloužená doba koagulace → vysoký příjem rybích olejů s obsahem kys. eikosapentaenové (20:5 ω 3 EPA)  z EPA vznikají PG 3 a TX 3, které inhibují uvolnění arachidonátu z fosfolipidů a tvorbu PG 2 a TX 2 (TXA 3 stimuluje agregaci slaběji než TXA 2 ⇒ rovnováha posunuta směrem od agregace)

Biologické funkce leukotrienů  LTs vznikají především v leukocytech (konkrétní druh závisí na typu buňky), které pro ně mají i receptory, spřažené s G-proteiny  mají velmi silný bronchokonstrikční účinek (působí kontrakci hladkého svalstva): LTC 4, LTD 4 a LTE 4 se souhrnně označují jako slow-reacting substance of anaphylaxis (SRS-A)  zvyšují permeabilitu cév  Působí chemotaktivně (LTB 4 ) a aktivačně na leukocyty (hlavně eosinofily a monocyty), podporují diapedézu do místa poškození (mj. zvyšují expresi integrinů na povrchu leukocytů a permeabilitu cév), zvyšují schopnost fagocytózy  regulují vazokonstrikci  ⇒ účastní se zánětlivých reakcí, přecitlivělostí (astma) i imunitní obrany proti infekcím

Biologické funkce lipoxinů  Na rozdíl od prozánětlivých eikosanoidů lipoxiny zánětlivou reakci brzdí  Hypotéza: v 1. fázi zánětlivé odpovědi – produkce leukotrienů (např. chemotaktického LTB 4, který řídí migraci leukocytů do místa poškození) → vzestup hladiny prostaglandinů (PGE 2 ), které „přepínají“ syntézu eikosanoidů z 5-LO dráhy (LTs) na 15-LO dráhu (LXs), ta v 2. fázi tvoří lipoxiny podporující ukončení akutního zánětu a bránící jeho přechodu v chronický  Proto se dnes intenzivně studuje potenciální terapeutické využití LXs v léčbě určitých zánětlivých onemocnění (glomerulonefritida)  Působí přes receptory spřažené s G-proteiny

Cytokiny

Co jsou cytokiny?  Skupina proteinů a peptidů (glykopeptidů)  Ovlivňují buněčný růst (též růstové faktory)  Přenos signálu od jedné buňky ke druhé  Významná skupina - lymfokiny (též interleukiny) - bílkoviny uvolňované z aktivovaných buněk imunitního systému a koordinující imunitní odpověď organizmu

Nomenklatura cytokinů  Lymfokiny - produkují aktivované T-lymfocyty, řídí odpověď imunitního systému signalizací mezi imunokompetentními buňkami  Interleukiny (IL) - cílové buňky jsou hlavně leukocyty  Chemokiny - specifická třída, zprostředkování chemotaxe mezi buňkami, stimulují pohyb leukocytů a regulují jejich migraci z krve do tkání  Monokiny - produkují hlavně mononukleární buňky, jako jsou makrofágy

Hlavní funkce cytokinů  Hematopoéza (např. CSF - colony stimulating factor)  Zánětlivé reakce (např. IL1 - interleukin, TNF - tumor necrosis factor)  Chemotaxe (např. IL8, MIP1- macrophage inflammatory protein 1, BLC – B-lymphocyte chemoatractant)  Imunostimulace (např. IL12, IFNg - interferon )  Imunosuprese (např. IL10)  Angiogeneze (např. VEGF- vascular endothelial growth factor)  Embryogeneze (např. TGF-b, LT - lymphotoxin)

Signalizace přes receptory cytokinů typu I a II Ligandem aktivovaný receptor (R) váže kinázu JAK (K). Fosforylace JAK a fosforylace receptoru. Fosforylované místo je určeno pro zakotvení STAT (Signal Transducer and Activator of Transkription) (S). JAK katalyzuje fosforylaci tyrosinu na STAT. Dvě fosforylované molekuly STAT vytvoří aktivní dimer. Dimer se přemístí do jádra, váže se na specifickou část DNA v oblasti promotoru cílového genu a aktivuje jeho expresi.

Receptory pro TNF  TNF je dominantním cytokinem v procesu zánětu  Extracelulární doména receptoru pro TNF je bohatá na cystein

Receptory pro chemokiny  Typická doména se sedmi transmembránovými úseky a charakteristickým motivem Asp-Arg-Tyr - "DRY„  Receptory většinou spojeny s G-proteinem

Interferony (IFN) a jejich signalizace  cytokiny s antivirovou aktivitou  působení je zprostředkováno přes buněčné receptory  antiproliferativní aktivita - schopnost zastavit buněčný růst → využití k léčbě řady onemocnění (tumory, virové infekce, autoimunitní onemocnění)  kontrola apoptózy  Imunomodulační schopnosti (IFN-  je hlavní činitel modulující imunitní odpověď, hlavní antivirový cytokin)

Biologická aktivita IFN  vazba na specifický receptor na povrchu buňky  aktivace signální dráhy JAK/STAT a aktivace transkripce cílového genu  JAK/STAT – rodina tyrozinkináz, jejichž hlavní funkcí je fosforylace receptorů pro cytokiny a růstové faktory  STAT – přenašeč signálů a aktivátor transkripce (protein aktivující transkripční faktor jako odpověď na vazbu extracelulární signální sloučeniny na povrchový buněčný receptor)  indukuje se syntéza nové mRNA Pozn: Jak – Janusova kináza (2 kinázová centra) STAT – signal transducers and activators of transcription

Děkuji za pozornost!