Vysokorozlišovací detekce mutací a polymorfismů na základě DNA denaturační analýzy s použitím kapilárního sekvenátoru M. Minárik, L. Fantová, R. Chudoba.

Slides:



Advertisements
Podobné prezentace
TROMBOFILNÍ MUTACE A RIZIKOVÉ FAKTORY U MLADÝCH DÍVEK ČESKÉ POPULACE UŽÍVAJÍCÍCH HORMONÁLNÍ ANTIKONCEPCI MUDr. Zdenka Vlčková GHC GENETICS, s.r.o. –
Advertisements

Genetické polymorfismy v kriminalistické historii
Studium lidského genomu
Monogenní a multigenní nemoci
Poznámky identifikaci SNP
Užití fragmentové analýzy a multiplex PCR s vícebarevným fluorescenčním značením k detekci nejčastějších mutací u dědičných neuropatií (HMSN). P. Seeman,
Kapalinová chromatografie v analytické toxikologii Věra Pacáková Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, katedra analytické chemie.
Vyšetření parametrů buněčné imunity
Masarykova nemocnice, o.z.
Real-time PCR - princip
Laboratoř potravinářské mikrobiologie (Rokoska)
Farmakogenetika a farmakogenomika.
YEAST AND CANCER Nobel Lecture, December 9, 2001 LELAND H. HARTWELL.
Molekulární diagnostika neurofibromatózy typu 1 Kratochvílová A., Kadlecová J., Ravčuková B., Kroupová P., Valášková I. a Gaillyová R. Odd. lékařské genetiky,
Polymorfizmy detekované speciálními metodami s vysokou rozlišovací schopností Stanovení jednonukleotidových polymorfizmů (Single Nucleotide Polymorphisms.
Projekt HUGO – milníky - I
STRATEGIE MOLEKULÁRNÍ GENETIKY
RNA savčí buňka: pg celkové RNA rRNA (28S,18S, 5S) 80-85%
(genové mutace, otcovství, příbuznost orgánů při transplantacích) RNA
RNA diagnostika neurofibromatózy typu 1 Kratochvílová A. , Kadlecová J
F.I.S.H. hotovo.
DNA diagnostika syndromu
Microarrays and chips M .Jurajda.
Polymorfismus lidské DNA.
Autor: Milan Blaha Konzultant: Prof. MVDr. Jan Motlík, DrSc.
Prediktivní a prognostická patologie Prediktivní a prognostická patologie Část I Část I.
MLPA MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION
Radovan Horák, Romana Zaoralová, Jiří Voller
RNA savčí buňka: pg celkové RNA rRNA (28S,18S, 5S) 80-85%
Vývoj mikrosatelitních markerů (SSR) KBO/125 Jiří Košnar, katedra botaniky PřF JU, 2012 Kurz byl financován z projektu FRVŠ 1904/2012.
DNA diagnostika.
Kvantifikace nukleových kyselin
DNA diagnostika II..
Single nucleotide polymorphisms (SNPs)
SINE Mikrosatelity.
Detekce bodové mutace v genu pro LDL receptor
Historie a metody genomiky
Technologické aspekty čipových technologií Boris Tichý LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno.
Praktikum z genetiky rostlin JS Genetické mapování mutace lycopodioformis Arabidopsis thaliana Genetické mapování genu odolnosti k padlí.
Farmakogenetika Cíl Na základě interdisciplinárního integrace znalostí farmakologie a genetiky popsat vliv dědičnosti na odpověď organismu.
Čipy pro analýzu genomu
Ý Filosofický princip ý Metodický potenciál ý Praktická aplikace: diagnostika, terapie, profylaxe a prevence Nové trendy v medicíně.
Čipy pro analýzu genomu
Molekulární biotechnologie č.10a Využití poznatků molekulární biotechnologie. Molekulární diagnostika.
SMAMII-8 Detekce polymorfismů v genomech. Metody molekulární diagnostiky Se zaměřují na vyhledávání rozdílů v sekvencích DNA a Identifikaci polymorfismů.
Analýza volné fetální DNA Iveta Valášková. Zdroje fetální DNA Invazivní výkony –amniové fibroblasty – při amniocentéze 0,5-1% riziko spontánních potratů,
Hereditární nádorové syndromy spojené s karcinomy kolorecta MUDr. Dagmar Štenglová, Genetika Plzeň s.r.o.
O. Topolčan 1, J. Kinkorová 2 1 Lékařská fakulta UK Plzeň a FN Plzeň, 2 Technologické centrum, AV ČR Praha Sponzorováno z projekt ů: CZ.1.07/2.3.00/ ,
RNA savčí buňka: pg celkové RNA rRNA (28S,18S, 5S) 80-85% tRNA, snRNA 15-20% mRNA 1-5% mRNA molekul/buňku, tj rozdílných transkriptů.
Biotechnologie, technologie budoucnosti Aleš Eichmeier.
Neurofibromatóza I von Recklinghausenova nemoc Zpracovali: Zuzana Melišová Peter Minárik Kateřina Matoušková Martin Šefčík.
Environmentální aplikace molekulární biologie
Nepřímá DNA diagnostika
Exonové, intronové, promotorové mutace
ModernÍ postupy v diagnosticke a lÉČbĚ paragangliomŮ hlavy a krku:
Metodologie molekulární fylogeneze a taxonomie hmyzu
Real-time PCR - princip
RT – PCR: návrh primerů.
Moderní metody analýzy genomu Čipové technologie I
Užití fragmentové analýzy a multiplex PCR s vícebarevným fluorescenčním značením k detekci nejčastějších mutací u dědičných neuropatií (HMSN). P. Seeman,
SYLABUS K PŘEDMĚTU GENETICKÁ EKOTOXIKOLOGIE
SYLABUS K PŘEDMĚTU GENETICKÁ EKOTOXIKOLOGIE
Polymerase chain reaction Polymerázová řetězová rekce
Ivana Eštočinová, Pavla Fabulová, Markéta Formánková
FRAGMENTAČNÍ ANALÝZA Eva Paděrová.
Studium lidského genomu
Základy genomiky V. Analýza protein-proteinových interakcí Jan Hejátko
Techniky molekulární biologie a genetiky
URČENÍ BAKTÉRIE RODU BORRELIA POMOCÍ DNA SEKVENACE
Multilocus DNA markery
Transkript prezentace:

Vysokorozlišovací detekce mutací a polymorfismů na základě DNA denaturační analýzy s použitím kapilárního sekvenátoru M. Minárik, L. Fantová, R. Chudoba , L. Benešová Laboratoř molekulární genetiky a onkologie Genomac International

Capillary Electrophoresis 1981 Jim Jorgenson - capillary zone electrophoresis (CZE) 1990 Beckman Instruments - first CE system with fluorescence detection 1996 Molecular Dynamics - first commercial capillary array system (CAE) 1998 Celera Genomics (Craig Venter) - high throughput sequencing by CAE 2000 Human Genome Project + Celera Genomics - draft genome sequence

Princip formování heteroduplexů (většinou součástí PCR programu) Denaturace Zchlazení + + 95°C 5min Wt Mt ssDNA Heteroduplexy Homoduplexy

(CE separace za podmínek částečné denaturace) Princip separace (CE separace za podmínek částečné denaturace) Teplota Teplota

Denaturant Gradient Gel electrophoresis (DGGE) Fischer, S.G. and L.S. Lerman, Proc Natl Acad Sci, 1983, 80, 1579-1583.

Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TGGE) Heteroduplexes Homoduplexes Riesner et al. Electrophoresis, 1989, 10, 377-389

Denaturing Capillary Electrophoresis 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 MUT-HET MUT-HOMO WT Time (min) LIF (488 nm / 520 nm) Khrapko et al. Nucleic Acids Res 1994, 22, 364-369

Denaturing Capillary Electrophoresis (labelled) primer with GC-clamp Genomic DNA standard primer 200 bp product

Profil 2 mutací v exonu 8 genu TP53 40 50 60 70 80 90 HET1-HET2 WT-HET2 WT-HET1 HOMO2 HOMO1 WT LIF (488 nm / 520 nm) Time (min)

Teplotní závislost 77.5 77.8 78.1 78.4 Temperature increase 78.7 79.0 Time 80.2 79.9 79.6 79.3 79.0 78.7 78.4 78.1 77.8 77.5 Temperature increase

Průběh vyšetření Výběr SNP nebo bodové mutace Vyhledání v databázi Tm Optimalizace CE-gradientu Potvrzení mutací sekvenováním Navržení primerů Optimalizace PCR VZOREK Izolace DNA PCR amplifikace a tvorba heteroduplexů TGCE Vyhodnocení

(CE separace za podmínek částečné denaturace) Metodika (CE separace za podmínek částečné denaturace) Vzorek DNA izolace PCR amplifikace CE analýza Vyhodnocení

„Mutační spektrometrie“ Vysoké rozlišení Specifické profily, charakteristické polohy píků

Vysoká citlivost Citlivost mutační detekce (<10% mutované DNA) mutant > 20% mutant < 10 % (mutační spektrometrie)

Aplikace

Prediktivní genetická diagnostika Testování výskytu mutací FVL Faktor V Leiden Faktor II prothrombin MTHFR CFTR Hemochromatóza Hypercholesterolémie Fenylketonurie

Onkologická diagnostika Testování somatických mutací KRAS2 TP53 APC EGFR CDKN (p16INK4A) BRCA1 BRCA2 APC 60 40 minutes 1442 + 1450 TA + C T 60 40 minutes 1450 CT

Genotypizace SNP pro predikci léčebné odpovědi/toxicity Farmakogenomika Genotypizace SNP pro predikci léčebné odpovědi/toxicity ERCC1 (C118T) ERCC2 (G312A) MDR1 (C3435T) CCND1 (A870G) CYP17A1 CYP3A4

Diagnostika predispozice nádorů Genotypizace SNP v predispozici výskytu nádorů CCND1 (A870G) SRD5A2

Diagnostické kity ABI PRISM® 310 ABI PRISM® 3100 Avant ABI PRISM® 3100 Beckman CEQ™ 8000 MegaBACE™ 500 MegaBACE™ 1000 Agilent Bioanalyzer 2100

Shrnutí Jednoduchý jednostupňový postup Citlivost při detekci somatických mutací Specificita (mutační spektrometrie) Bez nutnosti pořizování nákladné instrumentace Vysoká kapacita (multikapilární přístroje) Nízké náklady

Poděkování Laboratoř molekulární genetiky a onkologie, Genomac International, s.r.o. Patrik Sekerka Ing. Michala Hrabíková Ing. Radka Slováčková Kateřina Kramperová Barbora Belšánová Andrea Krajčová MUDr. Cyril Šálek Lucie Kašperová Podporováno projektem Ministerstva Průmyslu a Obchodu č. FI-IM3/215

Děkuji Vám za pozornost www.genomac.cz 224-458-048 Bavorská 856 Praha 5