Biosyntéza polyketidových antibiotik ve streptomycetách Laboratoř molekulární biologie aktinomycet

Chemická struktura látek ze skupiny manumycinu MANUMYCIN A ASUKAMYCIN MOENOMYCIN REDUCTIOMYCIN C5N jednotka BAFILOMYCIN B 1

Biologické aktivity metabolitů ze skupiny manumycinu MANUMYCINY A, E, F, G; ASUKAMYCIN, COLABOMYCIN Antibakteriální (zejména proti G + ) Protizánětlivá Anti-apoptotická Kancerostatická Další (insekticidní, kokcidiostatické, antifungální apod.) Další látky obsahující C 5 N jednotku MOENOMYCIN A Antibakteriální (zejména proti G + ), alternativa  -laktamů ve veterinární medicíně REDUCTIOMYCIN Antibakteriální, antifungální a protivirová (New Castle disease virus) BAFILOMYCIN B 1 Specifický vakuolární ATPasový inhibitor, inhibitor vesikulárního transportu kaspázy-1 neutrální sfingomyelinázy I  B kinázy Ras farnesyltransferázy acetylcholin esterázy mechanismem enzymové inhibice

Biosyntetický model manumycinových metabolitů Polyketidy – Biosyntetický model založený na výsledcích chemického značení molekul asukamycinu a manumycinu PKS-I C7N - dioxygenasa C5N - biosyntetické dráhy ALA

Biosyntetický genový shluk asukamycinu ze S. nodosus ssp. asukaensis

In silico analýza asukamycinového shluku

Disrupce als ve S. nodosus ssp. asukaensis WT als::apr

Metabolity produkované mutanty als a asu17

Biosyntetický model asukamycinu Řetězce jso syntetizovány PKS-II Epoxidace probíhá mechanismem monooxygenázy C 5 N vzniká pravděpodobně spolupůsobením ALAS a CoA-ligázy Gen asu5 kóduje aldolázu, podílející se na tvorbě mC 7 N Gen asu23-24 se podílí na biosyntéze cyklohexylového zbytku – startovací jednotky horního řetězce

TLC analýza produkčního média als mutantu 1, S. nodosus WT kmen; 2, als::aac(3)IV mutant; 3, als::aac(3)IV x pALS4; 4, als::aac(3)IV mutant s 20  g ml -1 ALA; 5, asukamycin

Metodika genetického screeningu pro vyhledávání nových producentů látek s C5N jednotkou Vysoká homologie DNA sekvence genu als u všech známých producentů (více než 80%) Vysoce konzervativní vnitřní fragment kódující sekvence als jako genová próba pro hybridizační screening: Jednoznačné výsledky – genomová DNA všech producentů hybridizuje, neprodukční kmeny bez signálu Vysoká citlivost V pilotním experimentu kromě známých kmenů analyzováno cca 60 nových izolátů aktinomycet z přírody – identifikace produkčního kmene S.sp.1/5 (původ - primární sukcese hnědouhelné výsypky, Mostecko) Pro snadnou identifikaci metabolitů s C5N jednotkou: C5N je UV chromofor Antibakteriální aktivita Transformace libovolného producenta expresním plasmidem pro nadexpresi genu als z S. nodosus specificky zvyšuje syntézu C5N- obsahujících látek minimálně o řád ALS GTR Dráha 1 – pIJ622 Dráha 2 – pALS4