Transport léčiv na polymerních nosičích Kurz „Biomateriály“, VŠCHT Praha Karel Ulbrich Ústav makromolekulární chemie AV ČR

Obsah přednášky Úvod do problematiky polymerních nosičů biologicky aktivních molekul Přehled systémů pro řízené uvolňování léčiv Polymerní konjugáty biologicky aktivních molekul (léčiv), protinádorová terapie Polymery pro diagnostiku Polymery při přípravě vektorů pro genové terapie Závěr a výhledy

Proč polymery? Co umožní použití syntetických polymerů při přípravě léčiv a lékových forem? Konc čas [ hod] 4 8 dny - rok Klasické nízkomolekulární léčivo Polymerní formy léčiv řízené uvolňování protrahovaný účinek řízené uvolňování cílený transport

Paul Ehrlich, 1908 „Magic Bullet“ Helmut Ringsdorf, 1976 model polymerního léčiva Nový obor zabývající se systémy pro dopravu léčiv „Drug delivery systems“ Controlled Release Society Advances in Drug Delivery Reviews Crical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems Journal of Controlled Release Journal of Drug Targeting Journal of Bioactive and Compatible Polymers Biomacromolecules Bioconjugate chemistry Macromolecular Bioscience Biomaterials

Požadavky na „ideální“ léčivo Biologicky aktivní látka (BAL, léčivo) je v lékové formě neaktivní, bez jakéhokoliv vlivu na organizmus (buňky imunitního systému, neukládá se v játrech, není vyloučeno ledvinami) v této formě je specificky dopraveno do místa požadovaného účinku (orgán, tkáň, buňka) aktivuje se pouze v místě požadovaného účinku, působí v požadované koncentraci působí po dobu optimální pro dosažení maximálního léčebného účinku léčivo, metabolity a všechny komponenty nosičového systému jsou po dosažení efektu eliminovány z organizmu

Polymerní systémy umožňující řízené uvolňování biologicky aktivních látek Systémy s řízeným uvolňováním BAL olejové kapky kapsule a potahované systémy matricové systémy membránové systémy mikroreservoáry systémy s aktivovaným uvolňováním Systémy pro cílený transport a řízené uvolňování BAL nano- a mikročástice, nanokapsule micely liposomy „prodrug“ systémy (ADEPT) rozpustné polymerní nosiče léčiv a konjugáty polymeru s proteinem polymerní systémy pro dopravu genu (genová terapie)

Olejové kapky Rychlost uvolňování řízena difuzí Olejová kapka léčivo koncentrace voda čas Rychlost uvolňování řízena difuzí závisí na rozdělovacím koeficientu olej-voda a rozpustnosti léčiva Materiál: sezamový olej, olivový olej, nízkomolekulární poly(orthoestery) Aplikace: transdermální, orální, parenterální podání Léčiva: léky nerozpustné nebo málo rozpustné ve vodě Consumpren (Cyclosporine - cyklický dekapeptid), Taxol, Docetaxel v oleji Lipidoil nebo Cremofor

Tablety, kapsule a potahované systémy Dispergované léčivo koncentrace Polymerní vrstva Polymerní matrice čas Materiál: Potah: želatina, polysacharidy, algináty, síťovaný albumin, Eudragity - kopolymery na bázi akrylátů a methakrylátů Matrice: Poly(ethylen oxid), Poly(vinylpyrrolidon) Poly(vinylalkohol) Uvolňování léčiva: rychlost rozpouštění matrice rychlost rozpouštění potahu difuzí léčiva Použití: orální podávání

Eudragity Eudradit L Eudradit E Eudradit RL Stálý v kyselém prostředí Rozpustný v alkalickém prostředí Eudradit E Rozpustný v žaludku Maskování chuti léčiv Ochrana proti vlhkosti Eudradit RL Nerozpustné, botnají, zpožděné uvolňování  

Uvolňování: řízeno difuzí Matricové systémy a) Nedegradovatelné koncentrace Řízená difuze čas Uvolňování: řízeno difuzí Materiál: Silikony, Polymethakryláty, polyakryláty, kopolymery vinylacetátu Aplikace: implantáty umožňující uvolňování léčiva po dobu i několika let poševní kroužky (hormonální antikoncepce) NuvaRing® silikonový kaučuk obsahující levonorgestrel, megestrol acetate, progesterone (uvolňování po dobu 90 dnů s rychlostí uvolňování 20 μg/den

Matricové systémy b) Degradovatelné – hydrofóbní polymer, povrchová erose polymeru Materiály: PLA/PGA kopolymery, poly(anhydridy), poly(orthoestery) Uvolňování: kombinace difuze a degradace, podle povahy léčiva Atridox® PLA Doxycyclin Onemocnění dásní Nutropin Depot® PLGA růstový hormon malý vzrůst Lupron Depot® leuropeptide rakovina prostaty Zoladex® goserelin Gliadel® degradovatelný polymerní implantát na bázi polyanhydridů léčivo – Carmustine, BCNU, léčbě mozkových nádorů bis-phenoxykarboxypropan anhydrid kyseliny sebakové 20 % 80 %

Matricové systémy b) Degradovatelné – hydrofilní gely, botnání, které vede až k rozpuštění gelu Materiál: Hydrogely na bázi kopolymerů (2-hydroxyetyl)methakrylátu N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu Uvolňování: kombinace difuse a degradace gelu Studovány gely obsahující kyselinu 5-aminosalicilovou, degradovatelné azoreduktásami přítomnými v tlustém střevě „Smart systems“, řízené uvolňování inzulinu z matrice s imobilizovanou glukosoxidásou

Membránové systémy pro dopravu léčiv zásobník léčiva membrána léčivo uvolňováno difusí přes membránu Poly(ethylenglykolmethakrylát) kopolymer ethylen-vinylacetát, silikonový kaučuk, síť. albumin

Transdermální systémy - náplasti Nezatěžuje GI trakt Prodloužená doba účinku Umožňuje aplikaci pacientem Neinvazivní metoda Zvyšuje pohodlí pacienta Snižuje vedlejší účinky Jednoduché odstranění zdroje léčiva Výhody: Nevýhody: Nízká prostupnost větších molekul přes pokožku Používání látek zlepšujících průnik léčiva pokožkou (DMSO) Dráždění pokožky Malá kapacita léčiva

Typy transdermálních systémů - náplastí Náplasti s polymerní matricí Roztok nebo suspenze léčiva je dispergován v polymerní matrici Náplasti s kapalným zásobníkem léčiva Roztok nebo suspenze léčiva je umístěn mezi ochrannou vrstvou a membránou, která řídí rychlost Náplasti s několika vrtvami polymerní matrice Léčivo dispergováno v adhezivní vrstvě i v polymerní matrici, oddělené membránou Náplasti s léčivem v adhezivní části Léčivo dispergováno v adhezivní vrstvě, v přímém kontaktu s pokožkou Polymerní matrice Zásobník léčiva Léčivo v adhezivní vrstvě Několika vrstevnaté Krycí vrstva Léčivo Membrána Adhezivní vrstva Pokožka

E-Trans® systém umožňuje dopravu širšího spektra léčiv s terapeuticky Název Ochranná vrstva Zásobník nebo matrice s léčivem Membrána Adhezivní vrstva Transderm Scop® Aluminizovaný polyester scopolamine light mineral oil polyisobutylene mikroporézní polypropylén light mineral oil polyisobutylene Nicorette® polyester Nikotin polyisobutylene polyisobutylen polybutylen Deponit® polypropylén nitroglycerin polyakrylát E-Trans® systém umožňuje dopravu širšího spektra léčiv s terapeuticky dostatečnou rychlostí Zvýšení průniku léčiva přes pokožku – iontoforéza, elektroporace, ultrazvuk

Systémy s aktivovaným uvolňováním Orálně aplikovatelné systémy pro řízené uvolňování léčiv OROS® a OROS® Push-PullTM Uvolňování léčiva je řízeno osmotickým tlakem polopropustná membrána jádro s roztokem léčiva roztok léčiva osmotické jádro, osmoticky aktivní sůl pružná diafragma Zásobní roztok léčiva OROS® OROS® Push-PullTM

Osmotická pumpa „Alzet“ Systémy s aktivovaným uvolňováním Implantáty - uvolňování léčiva je řízeno osmotickým tlakem Osmotická pumpa „Alzet“ Protilátky, chemotherapeutika, cytokiny, růstové faktory, hormony a peptidy

Nano a mikročásticové systémy Nanočástice: 5 – 1000 nm, mikročástice: 1 - 250 mm pasivní směrování: 10 - 1 000 nm játra, RES 4 - 200 mm plíce aktivní směrování: magnetit Fe3O4 Původně: Polymethylmethakrylát, polystyren poly(2-hydroxyethyl)methakrylát Biodegradovatelné: polykyanoakryláty, polyestery (PLA, PGA a jejich kopolymery), polyanhydridy, polyfosfazény. Albumin, želatina, ethylcelulosa, algináty mikrokapsule mikrosféry

Materiály pro přípravu nanočástic a nanokapsulí Syntetické hydrofobní polymery Biodegradovatelné – polyestery (PLA, PGA, PLGA), polyanhydridy, poly(ortho estery), polykyanoakryláty Nebiodegradovatelné – silikonový kaučuk, polymethylmethakrylát, kopolymer ethylén - vinylacetát

Přírodní hydrofilní materiály (hydrogely) albumin, želatina, karboxymethyl celulóza, dextrany, chitosan, algináty, hyaluronová kyselina Hyaluronová kyselina Skládá se z disacharidických jednotek glukoronové kyseliny a N-acetyl-glukosaminu Algináty: inearní kopolymer s homopolymerními bloky (1-4)-vázaného ß-D-mannuronátu (M) a jeho C-5 epimeru α-L-guluronátu (G) Chitosan: lineární polysacharid skládající se z náhodně distribuovaných ß-(1-4)-vázáných D-glukosaminových a N-acetyl-D-glukosaminových jednotek

Syntetické hydrofilní materiály, rozpustné polymery a hydrogely hydrofilní polymery • vodorozpustné poly(ethylén oxid), poly(α-aminokyseliny), poly(vinylpyrrolidon), poly[N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid] (HPMA, ) hydrogely poly(2-hydroxyehtylmethakrylát) (HEMA), HPMA atd. Požadavky na polymery: netoxické, biokompatibilní a neimunogenní

Micelární systémy DOX kritická micelární koncentrace blokové kopolymery typu A-B nebo A-B-A hydrofilní řetězec, PEG, PVP, PHEGlu hydrofobní řetězec, PMM, PS, PBzGlu, PBzAsp, PLA, PGA kritická micelární koncentrace pro polymery 10-6 – 10-7 mol/L. DOX

Liposomální systémy Příklad: Myocet®, Doxil® AmBisome® amphotericin B uměle připravené sférické částice o průměru okolo 0,1 – 1 μm tvořené membránou z fosfolipidové dvojvrstvy, podobné buněčné membráně hydrofilní hlava hydrofobní „ocas“ hydrofilní léčivo hydrofobní léčivo poly(ethylen oxid) Příklad: Myocet®, Doxil® Doxorubicin.HCl AmBisome® amphotericin B

Druhy liposomů klasický imunoliposomy + + + + + + „Stealth“ dlouhocirkulující kationtové

více než 90 % DOX.HCl je v liposomu Myocet® – liposomální doxorubicin, Doxil® – pegylovaný liposomální doxorubicin, pro léčbu metastázující rakoviny prsu N-(carbonyl-methoxypolyethylene glycol 2000)-1,2-distearoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine sodium salt (MPEG-DSPE), 3.19 mg/mL; fully hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC), 9.58 mg/mL; and cholesterol, 3.19 mg/mL. HSPC MPEG-DSPE více než 90 % DOX.HCl je v liposomu rozměr 100 nm Doxorubicin.hydrochlorid

„Prodrug“ systémy (ADEPT) „antibody-directed enzyme prodrug therapy“ Ab E AlaAla--DOX nádorová buňka AlaAla--DOX DOX průnik do buňky zánik buňky neaktivní aktivní Ab E Enzym Neaktivní léčivo Aktivní léčivo Alkalická fosfatáza Doxorubicin fosfát Doxorubicin Karboxypeptidáza A Methotrexát-alanin Methotrexát

Vodorozpustné polymerní konjugáty s léčivy, polymerní diagnostika

Požadavky na „ideální“ léčivo Biologicky aktivní látka (BAL, léčivo) je v lékové formě neaktivní, bez jakéhokoliv vlivu na organizmus (buňky imunitního systému, neukládá se v játrech, není vyloučeno ledvinami) v této formě je specificky dopraveno do místa požadovaného účinku (orgán, tkáň, buňka) aktivuje se pouze v místě požadovaného účinku, působí v požadované koncentraci působí po dobu optimální pro dosažení maximálního léčebného účinku léčivo, metabolity a všechny komponenty nosičového systému jsou po dosažení efektu eliminovány z organizmu

Schéma klasického polymerního léčiva Biodegradovatelná spojka (fosfát, cukr, oligopeptid, hydrolyticky štěpitelná spojka) Léčivo Směrující struktura: sacharid, lektin, protilátka (IgG a fragmenty), hormon, specifický oligopeptid

Schéma struktur polymerních konjugátů založených na multivalentním prekurzoru (a) Gd (MRI) (b) Radionuklid (c) Fluorescenční značka Lipofilní substituent HPMA kopolymer Reaktivní skupina Dedegradovatelná spojka Adenovirus (genová terapie) Léčivo Protilátka (peptid) (směrující skupina) Roubovaný polymer (pasivní směrování)

Multivalentní HPMA kopolymery používané pro syntézu polymerních konjugátů (příklad nejpoužívanějších struktur) Příprava klasickou a nebo řízenou (RAFT) radikálovou polymerizací N H C 2 S + 3 O x y H2 Gly z Cl 5 b SH NH2 R-C=O

Semitelechelické reaktivní polymerní prekursory syntézy polymerních konjugátů léčiv (HPMA kopolymery) Bifunkční iniciátor Polymerizace s přenosem Řízená polymerizace (RAFT) (a) C ( H 2 ) N 3 O S G l y P h e L u (b) HS-(CH2)2-COOH C H 2 3 O N x y H2 S 5 Polymer s navázaným léčivem a koncovou funkční skupinou Polymer s funkčními skupinami

Možnosti uvolňování léčiva z polymerního nosiče (b) (c) (a) Uvolnění v krevním řečišti Uvolnění ve tkáni po extravazaci Specifické uvolnění v cílových buňkách po endocytose Cévy Cévy

Interakce polymerních léčiv s buňkami Uvolnění léčiva (a) hydrolýza v endosomech, (b) enzymolýza v sekundárních lysosomech lysosom primární endosom pH 5 - 6 Jádro sekundární lysosom, pH 5, enzymy

Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv Stabilita v průběhu transportu = chemická vazba léčiva na nosič Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou) Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

Schéma klasického konjugátu poly(HPMA) s kancerostatikem doxorubicinem (enzymatická aktivace léčiva) O H C 3 2 NH a x N Enzymaticky degradovatelný oligopeptid: -GlyPheLeuGly- Místo enzymatického štěpení

Schéma hydrazonového konjugátu poly(HPMA) s kancerostatikem doxorubicin (pH závislá hydrolytická aktivace léčiva) N H O C 3 2 . l a x Jednoduchá vazba nebo spacer Místo hydrolytického štěpení

Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

Princip enzymaticky řízeného uvolňování léčiva z polymerního nosiče Gly-Phe-Leu-Gly--- NAp Model léčiva, léčivo (DOX) Spojka (oligopeptid) P4 P3 P2 P1 P1´ P1 P2´ P3´ Substrát (oligopeptid) S4 S3 S2 S1 S1´ S2´ S3´ Aktivní místo enzymu (proteázy) ENZYM

% UVOLNĚNÉHO DOXORUBICINU V SÉRU Uvolňování DOX z polymerů při inkubaci PHPMA-X-DOX konjugátů se směsí lysosomálních enzymů - tritosomů STRUKTURA % UVOLNĚNÉHO DOXORUBICINU V SÉRU 3 h 6 h 24 h -GFLG- 0.7 0.8 1.9 -GLFG- 0.5 1.5 -GG- 0.1 0.2

Uvolňování DOX z hydrazonových polymerů inkubovaných ve fosfátových pufrech o různém pH

Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou) Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

Princip pasivního směrování – akumulace polymerů v pevných nádorech (EPR efekt) (H. Maeda a kol.) Nádorová tkáň Normální tkáň Málo propustný endothel Porézní kapilární systém Fungující lymfatický systém Těsné kapiláry nebo chybějící lymfatický systém

Distribuce poly(HPMA) v myších (EPR efekt), Sarkom 180 (melanom B16F10) (i.v. injekce polymeru)

Konjugáty umožňující pasivní směrování do nádorů Nedegradovatelné polymerní nosiče (limit Mw ~ 50 000 g/mol) Micelární nosiče léčiv PEG PEG PEG Multiblokové biodegradovatelné nosiče Biodegradovatelné vysokomolekulární polymerní nosiče

Syntéza roubovaných konjugátů s řízeným uvolňováním Dox a řízenou biodegradací 2 A) N=Dox NH G L F G G F L N=Dox NH G G F L G NHN=Dox + Dox=NNH Dox=NNH B) N=Dox NH N H N H 2 N=Dox NH S S S S N H S + N H 2 S NHN=Dox NHN=Dox Dox=NNH Dox=NNH

Struktura micelárního PHPMA-DOX konjugátu (s cholesterolem a pH-řízeným uvolňováním DOX) Vodné prostředí Mw(pol) = 32 kDa I = 1.8 Mw(mic) = 170 kDa [DOX] = 7 wt% [cholesteryl] = 3.5 %mol dmic = 22 nm

Dendritické polymery, syntéza Polyamidoaminové jádro G2 G1 MW~1550 Diameter~ 2.2 nm NH2 number = 8 MW~3300 Diameter~ 2.9 nm NH2 number = 16 PAA dendrimer druhé generace Semitelechelický HPMA kopolymer PAA dendrimer třetí generace Mw~120 000 - 250000 In~2.0 to 2.6 Rh~10 - 14 nm Mw~80 000 - 150000 In~1.8 to 2.3 Rh~8 - 10.5 nm

Eliminace polymerních léčiv z krevního řečiště a akumulace do nádoru u B/6 myší nesoucích myší lymfom EL4. Porovnání s volným léčivem. Eliminace z oběhu Akumulace v nádoru

Aktivní směrování – internalizace polymerních léčiv v buňkách Uvolnění léčiva (a) hydrolýza v endosomech, (b) enzymolýza v sekundárních lysosomech lysosom primární endosom pH 5 - 6 Jádro sekundární lysosom, pH 5, enzymy

Schéma klasického protilátkou směrovaného konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace) 3 2 NH Oligopeptid -GlyPheLeuGly-

Schéma hvězdicového protilátkou směrovaného konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace) S-CH2CH2-CONH-- DOX X

Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

Schéma degradace roubovaného konjugátu (degradace v reduktivním prostředí buňky) N H N H 2 DOX DOX= N N H N H S =DOX N S S Degradace v cílové buňce DOX S S N H N H S 2 S =DOX N H N =DOX N H N DOX DOX = N H N H N H N 2 Vysokomolekulární léčivo s akumulací v pevném nádoru Nížemolekulární fragmenty vyloučitelné z organizmu

c(kathepsin B) = 5.10-7 mol/l c(glutathion) = 3.10-6 mol/l Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou GFLG po inkubaci s kathepsinem B c(kathepsin B) = 5.10-7 mol/l Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou -S-S- po inkubaci s glutathionem c(glutathion) = 3.10-6 mol/l Vylučovací mez polymeru ledvinami

(růst nádoru, doba přežití, váha) Biologická aktivita polymerních léčiv studovaná na modelových nádorech u myší (růst nádoru, doba přežití, váha) (a) Testy in vitro aktivity na buněčných liniích (b) In vivo testy na myších, terapeutický režim aplikace léčiva ( první aplikace po vytvoření nádoru, nejčastěji po 8 – 11 dnech od inokulace)

Inhibice proliferace buněk EL4 T-buněčné leukemie (IC50 – koncentrace potřebná pro inhibici proliferace 50 % buněk) Konjugát IC50, μg DOX/mL PHPMA-GFLG -DOX (PK1) 19.1 PHPMA-GFLG -DOX-ATG 11,8 PHPMA-GFLG -DOX (cis-aconityl) 4.74 PHPMA-GFLG -DOX (hydrazon) 0.13 PHPMA-GG -DOX (hydrazon) 0.08 PHPMA-aminohexanová kys.-DOX (hydrazon) 0.34 PHPMA-aminobenzoic ac.-DOX (hydrazon) 0.07 PHPMA-GFLG -DOX-ATG (hydrazon) 0.01 PHPMA-GFLG -DOX-NHNH2 (prekurzor) 100 DOX.HCl

Směrované PHPMA-DOX konjugáty, výsledky in vivo testů (Balb/c myši, BCL1 leukemie i.p., léčba i.v.) a) jedna dávka 5mg/kg, (hv 11 den) b) dvě dávky 11 a 14 den, 2x5mg/kg (kl)

Léčba C3H/HeN myší s 38C13 lymfomem (1x105, s. c. ) doxorubicinem (5x2 Léčba C3H/HeN myší s 38C13 lymfomem (1x105, s.c.) doxorubicinem (5x2.5 mg/kg) nebo polymer-DOX konjugáty (ekvivalent 5 mg/kg DOX) aplikovanými 8 a 11 den

Injekce jedné dávky i.v. 20 mg/kg DOX v den 10 Léčba myší kmene B/6 s nádorem myšího EL-4 T-buněčného lymfomu pomocí konjugátu HuIgG-PHPMA-DOX Injekce jedné dávky i.v. 20 mg/kg DOX v den 10

Lineární konjugáty PHPMA-DOX s hydrazonovou vazbou: výsledky in vivo testů, nesměrovaný lineární konjugát Myší T-buněčný lymfom EL4, myši C57BL/6, léčba i.p. 10 nebo 10 a 20 den Hydrolyticky štěpitelná vazba, pH závislá rychlost štěpení

Vysokomolekulární roubované polymerní konjugáty DOX (Hydrazon) – In vivo protinádorová aktivita 105 buněk T-buněčného lymfomu EL4 inokulovaných myším B/6 v den 0. Léčba: den 11. i.v. , jednoduchá dávka 15 mg DOX ekv./kg A – konjugát s enzymatickou degradací B – konjugát s reduktivní degradací

Vysokomolekulární micelární konjugáty PHPMA-DOX Doba přežití B/6 myší s inokulovaným EL-4 T-buněčným lymfomem (s.c.) léčených 8 (a příp. 12) den po inokulaci jednou nebo dvěma dávkami léčiva

Přežití C57BL/6 myší s retransplanovanými buňkami (105) myšího lymfomu EL-4, bez následné léčby Původní léčba: hydrazonový konjugát

Využití rozpustných polymerních konjugátů v diagnostice

Konjugát gadolinia pro diagnostiku (angiografii) magnetickou resonancí Hmotová spektroskopie: (5.19±0.28) %váh. Gd Kontrastní látka: 0.5 M (78 mg/ml Gd) MW: 24.8 kDa Mw/Mn: 1.92

Stabilita komplexu Gd-PHPMA Doba inkubace: 2 měsíce Relaxační časy T1, T2 (podélná a příčná vibrace) Stabilita komplexů ve fyziologickém roztoku (0,9 % NaCl) ve vodě

Cytotoxicita konjugátů gadolinia (lidské fibroblasty, trypan blue, kontrola Gd-DTPA (Magnevist) od firmy Schering) Doba inkubace 24 hodin 48 hodin Dead human fibroblast cells (MSU) [%] Kontrola PHPMA-Gd Gd-DTPA (1mM) (0.1mM) Kontrola PHPMA-Gd Gd-DTPA (1mM) (0.1mM)

MR-Angiografie, komplex poly(HPMA)-Gd Krysa, 1.5 T MR scanner: 0.02 mmol/kg HE45

Syntetické polymery jako součást vektorů pro genovou terapii

Požadavky na systém pro dopravu genu účinný v in vivo podmínkách Stabilita v krevním řečišti, minimální interakce s buňkami imunitního systému Extravazace do cílové tkáně Interakce s receptory cílových buněk Endocytoza Únik z endosomu do cytoplasmy Transport k buněčnému jádru Účinná transfekce a produkce aktivního proteinu

Systémy pro in vivo dopravu genu Biodegradovatelné nanočástice Kationtové liposomy Kationtové lipidy (lipoplexy) Interpolyelektrolytové (polykationtové) komplexy DNA (polyplexy) Virální systémy: retroviry, polymerem modifikované rekombinantní adenoviry

Interpolyelektrolytové komplexy (IPEC) polykationtů s DNA plasmidy (polyplexy)

Tvorba komplexu polykation-DNA Agregace částic + +/- = 1 : 1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Izolované komplexy + + + + +/- > 1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +/- >> 1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Směs polymeru s komplexem

c) Kvarterní ammoniové Polykationty použité pro přípravu IPEC a) Primární amíny b) Terciární amíny c) Kvarterní ammoniové soli MAEDA MAGEDA MAGGHMDA DMAEM DMAEMam TMAEM TMAEMam a) Primární amíny b) Terciární amíny c) Kvarterní ammoniové soli C H 2 3 O N ( ) 6 C H C H C H 3 3 3 C H C C H C C H C 2 2 2 C O C O C O O O N H ( C H ) ( C H 2 ) 2 ( C H 2 ) 2 2 2 N H 3 C N C H 3 H 3 C N C H 3 H 3 C C H 3 C H C l - C H C l - 3 3 DMAEM DMAEMam TMAEM TMAEMam MAEDA MAGEDA MAGGHMDA

Polykationty použitelné pro přípravu IPEC H C H 2 N H C O H C H 2 C H 2 N H 2 C H 2 C H 2 N H C H 2 C H 2 N A I B N C H 2 C H 2 N H PEI C H 2 C H N H C O H PLL H N C O 2 N a O H C H C H 2 N H 2 PVA

Uvnitř buňky při pH < 6 se plasmid uvolní z endosomu Multifunkční polykationtový vektor pro dopravu genu připravený kondensací DNA s blokovými kopolymery polykationtů a hydrofilních polymerů + + + + + + + + + + plasmid pH 7,4 stabilní při dopravě Fusogení molekula (peptid) Uvnitř buňky při pH < 6 se plasmid uvolní z endosomu Směrující jednotka Hydrolyticky labilní vazba (při pH < 6)

Stabilita polykationtového komplexu DNA stabilizovaného hydrofilním PHPMA kopolymerem při inkubaci s DNAzou (fosfátový pufr, pH 7.4, 37 °C)

Povrchová úprava IPEC pomocí HPMA kopolymeru, využití pro cílenou dopravu IPEC pomocí aktivních proteinů nebo oligopeptidů NH2 NH2 ONp NH2 NH2 ONp + NH2 ONp NH2 NH2 ONp NH2 NH2 + NH2 ONp NH2 NH protein (IgG, transferin) oligopeptid

Průnik do buněk K562 (lidská leukemie) a účinnost transfekce komplexů pLL/DNA (gen kódující ß-Gal). Směrování transferinem. Průnik PL/DNA komplexu do buněk, vliv směrování Účinnost přenosu genu v in vitro podmínkách

Virální systémy, rekombinantní adenoviry

Adenovir: Potenciální vektor pro nádorovou genovou terapii Požadavky na intravenozní aplikaci: Virus se nesmí vázat na erythrocyty a neutrofily Nesmí napadat makrofágy a buňky RES Nesmí docházet k neutralizaci protilátkami a komplementem Nesmí docházet k záchytu viru v jaterních buňkách Musí být schopen specifického směrování k vybraným buňkám (retargeting) Receptory: coxsackie a adenovirus receptory (CAR), receptory pro „fibre knob“ ligandy

Klasický multivalentní polymer se směrující skupinou Povrchová modifikace viru hydrofilním polymerem Reaktivní esterová skupina Aminoskupina + Semitelechelický monovalentní polymer Virus + Klasický multivalentní polymer se směrující skupinou Modifikovaný virus

Osud povrchově modifikovaného viru v cílové buňce Prostředí v buňce Extracelární prostředí Ochranný polymer adenovirová kapsida Přesměrovaný virus endosom pH < 6 GSH Směrující struktura Uvolnění DNA Degradovatelné vazby Buněčná membrána

Příklad HPMA kopolymerů určených pro povrchovou úpravu virálních nosičů genu 3 C H 3 C H 3 C H 3 C H 2 C C H 2 C C H 2 C C H 2 C C O C O C O C O N H O N H N H C H 2 ( C H 2 ) 2 ( C H 2 ) 2 ( C H 2 ) 2 C H O H C H 3 N C H 3 N H N H C H C l 3 C H 3 C O C O ( C H 2 ) 2 ( C H ) 2 2 Reduktivně štěpitelná vazba (v cytoplasmě) S S S S ( C H ) 2 2 ( C H 2 ) 2 C O C O N EGF S S

Množství nemodifikovaných a polymerem modifikovaných virů v krvi po 30 min od aplikace (% vstupní dávky, myši BALB/C) Modifikace viru polymerem a vhodná dávka vede ke snížení poměru počtu virů v játrech vers. krev z poměru >2000 na <1.

Asociace s buňkami (FACS) Transgenní exprese genu Polymerem modifikovaný nesměrovaný adenovirus Ad5-GFP ztrácí schopnost účinně infikovat buňky (A549 – plicní nádor) Polymerem modifikovaný virus Virus retargetovaný pomocí bFGF Nemodifikovaný virus Asociace s buňkami (FACS) Transgenní exprese genu Ad5-GFP

Retargeting adenoviru (Ad5-luc) pomocí EGF (epidermální růstový faktor) Vaginální nádor A431 Ovariální nádor SKOV 3 100 1000 10000 100000 1000000 virus pc-virus EGF-pc-virus Luciferase (RLU) 1000000 100000 Luciferase (RLU) 10000 1000 100 virus pc-virus EGF-pc-virus

Exprese polymerem modifikovaného viru Ad5-GFP směrovaného humanizovanou protilátkou herceptinem PHPMA modi-fikovaný virus Herceptinem retargetovaný virus Buňky Virus SKOV3 Ovariální nádor K562 Lidská leukemie

Závěry Polykationty tvoří dostatečně malé a stabilní komplexy s DNA a plasmidy Stabilitu polykationt/DNA komplexu je možné ovlivňovat strukturou polykationtu a modifikací povrchu komplexu hydrofilním polymerem Účinnost transfekce IPE komplexů může být ovlivňována změnami struktury komplexu a zavedením funkčních molekul (směrování) Modifikace adenoviru hydrofilním HPMA kopolymerem vede k prodloužené cirkulaci viru v krvi a až k 1000 násobné redukci exprese genu (poklesu nespecificke infektivity). Expresi genu je možné obnovit specifickým směrováním polymerem modifikovaného viru pomocí specifických oligopeptidů i proteinů (transferin, herceptin). Specifita směrování virálního vektoru je výrazně závislá na struktuře směrující molekuly IPEC i polymerem modifikované viry jsou slibnými vektory s potenciálním využitím v genové terapii