Určení rodičů (analýza paternity)
Techniky Dříve minisatelitový DNA fingerprinting alozymy, mtDNA Dnes převážně mikrosatelity Další možnosti: AFLP, SNPs, proteinový fingerprinting
mikrosatelity Tandemová opakování krátkých motivů Např. (CTTT)n Někdy i složitější (CTTT)n (CA)n Vysoce polymorfní Jednoduchá dědičnost Využití: analýza paternity, identity, populační struktury… CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTC CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT
PCR Polymerase chain reaction (jak z málo DNA udělat hodně)
PCR Z celkové DNA si namnožíme jen úsek, který nás zajímá. Co se bude množit? To určí primery. Primery – krátké oligonukleotidy komplementární k úsekům ohraničujícím místo našeho zájmu. primer AGGGGACGTACACTCAGCTTT templát TCCCCTGCATGTGAGTCGAAA primer DNA templátu tento úsek se bude množit
Při ochlazení dojde k reasociaci Denaturace (obvykle 95°C) při zvýšení teploty se oddělí komplementární vlákna DNA Při ochlazení dojde k reasociaci
Primery přidané v nadbytku kmitají díky Brownově pohybu Některé se dostanou do blízkosti komplementárních míst
V úseku mezi primery zůstanou vlákna DNA oddělena Při ochlazení primery přisednou rychleji než dojde k vzájemné reasociaci dlouhých vláken DNA (obvykle 50 - 65°C) V úseku mezi primery zůstanou vlákna DNA oddělena
Primery jsou prodlužovány přidáváním nukleotidů podle sekvence templátu (obvykle 72°C – optimum pro Taq polymerázu)
Při dalším zahřátí dojde k oddělení templátu a nově vzniklých vláken
Po ochlazení primery přisednou na templát i nově vzniklé fragmenty
Při 72°C dojde opět k prodlužování primerů a vzniku nových kopií
Při dalším zahřátí…
Ochlazení – nasednutí primerů 72°C vznik nových fragmentů 95°C denaturace
Alely se liší délkou CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTC + CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT
Fragmentační analýza Probíhá v sekvenátoru
Elektroforéza kapilára gel
Elektroforéza kapilára gel laserový paprsek detektor
primer primer primer primer Fluorescenční značení CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT primer primer GAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAA Fluorescenční značení CTTTCTTTCTTTCTTT primer primer GAAAGAAAGAAAGAAA
Multiplex Více dvojic primerů v jedné reakci Různé značení Analýza se standardem standard
Určení paternity Matka Otec Mládě 1 Mládě 2
Určení paternity prostým vyloučením (simple exclusion)
genotypy Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4 55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439 56 Matka 195 254 196 232 233 297 57 230 212 267 58 59 184 204 273 60 Možní otci 73 94 200 243 305 379 1004 256 264 224 228 1005 274 180 245 289 1006 176 234 347 410 1007 146 214 25 168 301 1003 217
Identifikace mateřských alel u mláďat (na prvním lokusu málo alel – nebudeme se jím zabývat) Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4 55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439 56 Matka 195 254 196 232 233 297 57 230 212 267 58 59 184 204 273 60 73 94 200 243 305 379 1004 256 264 224 228 1005 274 180 245 289 1006 176 234 347 410 1007 146 214 25 168 301 1003 217
Zjištěni shody otcovských alel s alelami sociálního partnera → nalezení mimopárových mláďat Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4 55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439 56 Matka 195 254 196 232 233 297 57 230 212 267 58 59 184 204 273 60 73 94 200 243 305 379 1004 256 264 224 228 1005 274 180 245 289 1006 176 234 347 410 1007 146 214 25 168 301 1003 217
Dohledání genetických otců mimopárových mláďat mládě 57 Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4 55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439 56 Matka 195 254 196 232 233 297 57 230 212 267 58 59 184 204 273 60 73 94 200 243 305 379 1004 256 264 224 228 1005 274 180 245 289 1006 176 234 347 410 1007 146 214 25 168 301 1003 217
Dohledání genetických otců mimopárových mláďat mládě 59 Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4 55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439 56 Matka 195 254 196 232 233 297 57 230 212 267 58 59 184 204 273 60 73 94 200 243 305 379 1004 256 264 224 228 1005 274 180 245 289 1006 176 234 347 410 1007 146 214 25 168 301 1003 217
Databáze na internetu
DATABÁZE PROGRAMY Primární databáze DNA sekvencí GenBank (Amerika) EMBL (Evropa) DDBJ (Japonsko) BLAST Na stránkách NCBI, Ensembl BLAT Na stránkách USCS Primer3 – navrhování primerů In Silico PCR RepeatMasker Databáze genů Entrez Gene RefSeq Databáze genových expresních dat UniGene GEO Důležité odkazy NCBI - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ tam najdu skoro vše: GenBank, Entrez Gene, UniGene, MapViewer, BLAST… ENSEMBL - http://www.ensembl.org/ Genome Browser, BLAST USCS – http://genome.ucsc.edu/ Genome Browser, BLAT, In Silico PCR Databáze genomů NCBI Ensembl UCSC Genome Browser
FASTA >gi|gi-number|gb|accession|locus – description GATCCTCCATATACAACGGTATCTCCACCTCAGGTTTAGATCTCAACAACGGAACCATTGCCGACATGAGACAGTTAGGTATCGTCGAGAGTTACAAGCTAAAACGAGCAGTAGTCAGCTCTGCATCTGAAGCCGCTGAAGTTCTACTAAGGGTGGATAACATCATCCGTGCAAGACCAAGAACCGCCAATAGACAACATATGTAACATATTTAGGATATACCTCGAAAATAATAAACCGCCACACTGTCATTATTATAATTAGAAACAGAACGCAAAAATTATCCACTATATAATTCAAAGACGCGAAAAAAAAAGAACAACGCGTCATAGAACTTTTGGCAATTCGCGTCACAAATAAATTTTGGCAACTTATGTTTCCTCTTCGAGCAGTACTCGAGCCCTGTCTCAAGAATGTAATAATACCCATCGTAGGTATGGTTAAAGATAGCATCTCCACAACCTCAAAGCTCCTTGCCGAGAGTCGCCCTCCTTTGTCGAGTAATTTTCACTTTTCATATGAGAACTTATTTTCTTATTCTTTACTCTCACATCCTGTAG
GenBank Obsahuje velmi podrobnou informaci o sekvenci: Locus Základní vlastnosti sekvence (název, délka, typ) Definition Výpis genů v sekvenci Accession Databázové přístupové číslo Version Verze dané sekvence Keywords Pod kterými klíčovými slovy ji lze najít Source organism Zařazení v systému Reference Článek, kde byla daná sekvence publikována Features Podrobný popis jednotlivých genů včetně jejich pozic Origin Sekvence
Sekvence v genetické bance Jsou známy nějaké sekvence mamuta? Z jakého druhu mamuta jsou známé sekvence? (nejlépe cytochrom b) NCBI National Centre for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Čemu je tato sekvence podobná? Chceme-li vyhledat sekvenci nejpodobnější k námi osekvenovanému neznámému vzorku, využijeme BLAST, opět na stránkách NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAST Hledá lokální (částečné) podobnosti Basic Local Alignment SearchTool =========================================== Hledá lokální (částečné) podobnosti Na rozdíl od klasického alignmentu umožňuje velmi rychle a efektivně prohledávat velké databáze
Úloha Ze zbytků potravy medvěda v Pyrenejích jsem získal dvě sekvence. Čemu jsou tyto sekvence podobné? >sekvence1 atgaccaatattcgaaaaactcacccactaataaaaattgtaaacaacgcattcattgacctcccagctccgtcaaacatctcatcatgatgaaactttggctccctcctaggcatctgc >sekvence2 ctagccatgcactactcaccagacgcctcaaccgccttttcatcaatcgcccacatcactcgagacgtaaattatggctgaatcatccgctaccttcacgccaatggcgcctcaatattctttatctgcctcttcctacacatcgggcgaggcctatattacggatcatttctctactcagaaacctgaaacatcggcattatcctcctgcttgcaactatagcaacagcctt cataggctatgtcctcccgtgaggacaaatatcattctga Postup: Na stránce NCBI zadám, že chci použít BLAST. Pod možnostmi Basic BLAST vyhledám nucleotide BLAST a zadám tuto možnost. Do okénka vložím sekvenci například ve FASTA formátu. V možnosti Database zadám Others. Spustím BLAST.