YEAST AND CANCER Nobel Lecture, December 9, 2001 LELAND H. HARTWELL
Modelový organismus vycházel ze studia virové morfogeneze zvolil si za svůj model S. cerevisiae: - má eukaryotický buněčný cyklus (fáze G1, S, G2 a M) - má dělící vřeténko
Studium mutantů teplotně-senzitivní mutanti rostou při pokojové teplotě, ale jejich růst se zastaví při 36° C izolace cca 1000 různých mutantů charakterizace změn ve složení proteinů, syntéze DNA, buněčném dělení a buněčné morfologii po přechodu z normální teploty na teplotu represivní
Fotomikroskopie na začátku BC tvoří kvasinky na svém povrchu malé pupeny, které se v průběhu cyklu zvětšují z morfologie buňky lze snadno zjistit v jaké fázi BC se zrovna nachází normální teplota => asynchronně se dělící masa buněk restriktivní teplota => BC všech mutantních buněk se zastaví na stejném místě
Fotomikroskopie
morfologie všech zastavených buněk je stejná, stejně jako morfologie jejich jader mutanti byli uspořádáni podle toho jak daleko pokročil BC než se zastavil (analyzováno bylo pučení, syntéza DNA, jaderné dělení a buněčné dělení) proces, který se po změně teploty zastavil jako první, byl považován za primární defekt
Fotomikroskopie
některé buňky úplně zastavily svůj vývoj a vytvořily terminální fenotyp u některých BC poktačoval v každé sledované části BC se našel mutant s primárním defektem fenotyp mutantů napovídal, že BC bude sestávat z poměrně jednoduché dráhy na sobě závislých regulačních kroků
cdc mutace
CDC28 první krok BC, kontrolovaný genem CDC28, je požadován k iniciaci dvou drah 1. pučení -> migrace jádra -> cytokineze -> oddělení buněk 2. replikace DNA -> rozdělení jádra -> cytokineze -> oddělení buněk potvrzeno pomocí různých double mutantů
CDC28
Dělící vřeténko podrobnější analýza mutantů, hlavně jejich dělícího vřeténka, pomocí elektronové mikroskopie objev mutantů v krocích nezbytných pro iniciaci syntézy DNA: cdc28...duplikace dělícího vřeténka cdc4...separace pólů d. vřeténka cdc7...iniciace syntézy DNA
Dělící vřeténko
Mating faktor zastavuje buňky přednostně v kroku CDC28 když se smíchají asynchronní kultury Mata a Matα všechny buňky se zastaví v G1 fázi, ve které spolu také fůzují studium pomocí elektronového mikroskopu -> fůze jader v zygotě probíhá ve stejnou chvíli jako spojení dvou dělících vřetének -> nově vytvořené diploidní jádro začne BC ve fázi G1
Mating faktor
CDC28 krok = start CDC28 je prvním krokem BC, po kterém se cyklus může větvit probíhá interakce mezi růstem a dělením nenastane, dokud buňka nedosáhne specifické velikosti pokud proběhne, buňka může dokončit cyklus aniž by vyrostla
CDC28 krok = start
CDC28 cdc28 = protein kináza cdc28 cdc2 (S. pombe) MPF (Xenopus) => cyklin dependentní kinázy (P. Nurse)
Ztráta přesnosti dělení rakovinné buňky se nejen dělí když nemají, ale mají i o dost horší přesnost dělení než normální buňky chromozomové aberace i ztráty celých chromozomů teplotně senzitivní mutanti rostoucí při maximální povolené teplotě mutace v zásadním bodě BC může způsobovat genetickou nestabilitu nádorových buněk
Ztráta přesnosti dělení
Kontrola poškození DNA mutanti senzitivní na radioaktivní záření někteří neumějí zastavit svůj BC kontrola poškození DNA (DNA damage checkpoint) rad9 mutant..nárůst ztráty chromozomů
Kontrola poškození DNA
Řízení buněčného cyklu „hodiny“ dáváné do pohybu periodicky pomocí cyklinů, nezávislé na tom co se v buňce děje X série na sobě závislých událostí, kde musí jedna úspěšně proběhnout aby mohla následovat druhá => hodiny, ale s checkpointy