Průmyslová toxikologie (C867) Laboratorní postupy testování toxicity průmyslových chemikálií – část I Průmyslová toxikologie (C867)

Posouzení nebezpečnosti PrCHL pro lidské zdraví CÍL odvodit hodnoty expozice látek, jež by pro člověka neměly být překročeny CESTA získat informace o nepříznivých (toxických) účincích na zdraví způsobené expozicí látky nebo přípravku. INFORMACE O toxikokinetice, metabolismu a distribuci akutních účincích (akutní toxicita, dráždivost a žíravost) senzibilizaci toxicitě po opakovaných dávkách účincích CMR (karcinogenita, mutagenita a toxicita pro reprodukci) účincích na činnost hormonů

Strategie zkoušení - minimalizace počtu zvířat Metody: in silico – modelové systémy na počítači in vitro – pokusy mimo živé tělo (vitrum = zkumavka) ex vivo – pokusy mimo živé tělo in vivo – pokusy v živém organismu Strategie zkoušení v praxi počítačové modely a databáze = predikce toxicity alternativní metody in vitro = predikce dávky nové metody in vivo = mechanismus působení v organismu, na omezeném počtu zvířat s použitím zobrazovací techniky

Strategie zkoušení - minimalizace počtu zvířat Replacement = nahrazení: metody in vitro mimo živý organismus = ALTERNATIVY BEZ POUŽITÍ ZVÍŘAT Reduction = redukce počtu: in vivo = v živém organismu, na omezeném počtu pokusných zvířat Refinement = zmírnění: in vivo, ex vivo = živý organismus, upravené metody experimentování Koncepci alternativ k pokusům na zvířatech položili Russel a Burch 1959 v knize „Principy humánní experimentální techniky“. Alternativy zahrnují všechny postupy, které mohou buď úplně, nahradit pokusy na zvířatech, nebo snižovat počet používaných zvířat, nebo alespoň zmenšovat jejich utrpení v pokusech, které podstupují zvířata proto, aby byly uspokojeny základní potřeby člověka, nebo jiných zvířat“. (Přesná definice Smyth, 1978 Fram, Bals 1983)

Toxikologické testování EXPOZICE - ČAS - CESTA Podle času Akutní jednorázová, krátkodobá Subakutní opakovaná, 14; 28-denní Subchronická opakovaná 90-denní Chronická opakovaná 6; 12; 24 měsíců Podle cesty vstupu do organismu – Orální – do zažívacího traktu ve vodě; v krmení; sondou Dermální – na kůži Inhalační – do respiračního traktu Způsob podání – přiblížit se možné expozici pro člověka !

Laboratorní zvířata Konvenční typ zvířat otevřený chov za dodržení základních hygienických pravidel, nedefinovaná mikroflóra. SPF (Specific pathogen free) bariérový chov – přísná hygienická pravidla, Nesmí být přítomny specifické patogeny pro daná laboratorní zvířata Axenická – Germ-free chov ve sterilním prostředí v bezmikrobních izolátorech bez mikroflóry v zažívacím traktu a na povrchu těla Gnotobiotická zvířata chov ve sterilním prostředí – bezmikróbní izolátory + velmi dobře definovaná střevní mikroflóra = očkování specifické mikroflóry axenickým zvířatům

Testování na zvířatech - Legislativa ČR Zákon a. 246/1992 Sb., na ochranu zvířat proti týrání přednostně používat alternativní metody. Vyhláška o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat zajistit standardní podmínky pro experimentální zvířata Nejčastěji používaná laboratorní zvířata Myš laboratorní Potkan laboratorní Morče domácí Křeček Králík domácí Pes domácí Prase domácí Ptáci Ryby

Testy na zvířatech – podmínky ve viváriích TEPLOTA Zachování tepelné rovnováhy, v němž je organismus v klidovém stavu Myš, Potkan, Morče – 22 + 2 °C, Králík, Pes 18 + 3 °C, Prase, Ovce 17 + 7 °C VLHKOST VZDUCHU V prostorách pro zvířata je nutná stálá relativní vlhkost cca 55 + 10 %. Rozmezí 30 – 70% . Jiné po dobu delší než 48 hodin = nepřiměřený stres. SVĚTLO: intenzita, kvalita, Doporučen světelný režim 12 hodin světlo- 12 hodin tma Intenzita osvětlení do 200 lx. Pouze při ošetřování 1000 – 1300 lx. Citlivost u albinotických zvířat. Postupné stmívání vyžadují jen kuřata. Denní světlo požadují: opice, pes, kočka. Nevhodné pro hlodavce.

Testy na zvířatech – podmínky ve viváriích AKLIMATIZACE před experimentem minimálně 5 dnů po dodání z chovného zařízení VODA pitná voda (ad libitum), stálá kontrola kvality POTRAVA standardní peletovaná krmná směs určená pro daný druh zvířete KONTROLA ZDRAVOTNÍHO STAVU permanentní kontrola = bakteriologické a parazitologické vyšetření určitého vzorku experimentální zvířat KONTROLA PROSTŘEDÍ monitorování čistoty prostředí ve viváriu – mikrobiologické vyšetření stěrů z chovných nádob a jiného technologického zařízení

Akutní toxicita orální – OECD 420, 423, 425 DEFINICE nepříznivé účinky látky, které se projeví po orálním podání jedné dávky nebo více dávek látky během 24h. Strategie testování: 1. in silico 2. in vivo – v současné době není vhodná in vitro metoda TESTOVACÍ METODA pokusné zvíře – albinotický potkan (3 ks na dávku) příprava zvířat - odebrání potravy – 24h před testem, vážení limitní test – výchozí dávka 2000 mg/kg a) negativní výsledek – test ukončen b) úhyn - úplná studie – následné dávky – 300, 50 a 5 mg/kg.

Akutní toxicita orální – OECD 420, 423, 425 KLINICKÁ VYŠETŘENÍ příznaky toxicity – změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevníhooběhu, vegetativního a centrálního nervového systému, motorické aktivity a chování. Pozornost bude věnována také výskytu třesu, křečím, slinění, průjmu, letargii, spánku a kómatu. MAKROSKOPICKÁ PITVA u všech zvířat použitých ve studii (uhynulých i utracených). Utracení bude provedeno vet. přípravkem T 61 inj. ad us vet. (15. den testu). VÝSLEDEK TESTU LD50 ekvivalentních dávek – kategorie A 50 – 5 mg/kg – velmi toxický B 300 – 50 mg/kg – toxický C 300 – 2000 mg/kg – škodlivý D 2000 – 5000 mg/kg - netoxický

Akutní toxicita inhalační – OECD 403 albinotický potkan - obojí pohlaví příprava test. látky – příslušná koncentrace v ovzduší inhalační box – průtok vzduchu, sledování koncentrace v dýchací zóně, měření teploty a vlhkosti limitní test – nejméně 4 hod expozice, c=20 mg/L plynu, par, aerosolu nebo 5 mg/L pevné látky toxické účinky nepozorovány - ukončení studie úhyn – celá studie, expoziční koncentrace – nejméně 3 hladiny (10 zvířat pro jednu dávku 5+5) pozorování – 14 dní , makroskopická pitva stanovení LC50 (letální koncentrace = 50% úhyn)

Akutní toxicita inhalační – OECD 403 Systém pro inhalační expozici plynům a aerosolům

Akutní toxicita dermální – OECD 404 albinotický potkan - obojí pohlaví příprava zvířat – holení (24h. před začátkem testování), vážení aplikace rovnoměrně na plochu asi 10% celkového povrchu těla – látka navlhčena – zajištění dobrého kontaktu s kůží S (mm2) = hmotnost (g) x 0,66 x délka těla (mm) doba expozice – 24h. – testovaná látka je fixována pomocí mulového obvazu a nedráždivé náplasti – zabránění orálnímu příjmu ukončení aplikace – zbytky odstraněny omytím vodou pozorování – 14 dní , makroskopická pitva

Testy kožní dráždivosti a leptavosti DEFINICE stanovení dráždivých/leptavých účinků po jednorázovém nanesení testované látky na kůži. Strategie testování: 1. In silico + pH testované látky 2. In vitro – modely lidské kůže EpiDerm, EPISKIN 3. In vivo – pokusné zvíře albinotický králík

Testy kožní dráždivosti a leptavosti In-vitro – Modely lidské kůže EpiDerm a Episkin Princip: trojrozměrný model lidské kůže - rekonstruované epidermis s funkční stratum corneum účinek testované látky na životnost buněk cytotoxicita je vyjádřena jako redukce aktivity mitochondriální dehydrogenázy Provedení: testovaná látka je umístěny na stratum corneum epidermálního modelu ve 2 epozičních časech. Expozice je ukončena omytím fosfátovým pufrem. Poté jsou tkáně inkubovány s MTT (žlutá tetrazoliová sůl). Pokud jsou buňky živé, MTT je v mitochondriích redukován sukcinát dehydrogenázou na modrý formazanový precipitát. Ten je přes noc z buněk vyextrahován okyseleným izopropanolem a kvantifikován spektrofotometricky. Použití: testy leptavých účinků na modelech lidské kůže jsou schopny rozlišit dráždivé a leptavé účinky.

Testy kožní dráždivosti a leptavosti EPISKIN MTT Formazan

Testy kožní dráždivosti a leptavosti Pozorovaná barevná změna při in-vitro testu na kožním modelu Episkin

Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na kůži - OECD 404 In vivo test nelze použít pro látky s pH menším než 2 a vyšší než 11,5 TESTOVACÍ METODA pokusné zvířa – albinotický králík plemene Novozélandský bílý bez rozlišení pohlaví - dávka – 0,5 ml nebo 0,5 g (zaleží na skupenství) - před aplikací oholení kůže ve hřbetní krajině, vážení zvířete aplikace testované látky (6cm²) - fixace pomocí mulového obvazu a nedráždivé náplasti (u pevných testovaných látek – smočení vodou – lepší kontakt s kůží)

Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na kůži - OECD 404 Počáteční zkouška – 1 zvíře – expozice: 3 min., 1h., 4h. Potvrzující zkouška - 2 zvířata - expozice: 4h. pozorování - stupeň podráždění kůže - příznaky erytému a edému za 1 hod, 24, 48, 72 hodin a dále pokud je nutné 1x denně po dobu 14 dnů jiné toxické účinky (pitva jen v závažných případech toxicity) HODNOCENÍ VÝSLEDKU TESTU stupeň podráždění kůže, vratnost či nevratnost kožních lézí

Testy oční dráždivosti a leptavosti DEFINICE stanovení dráždivých a leptavých účinků na oči po jednorázové aplikaci testované látky do oka Strategie testování: 1. In silico 2. In vitro – modely EpiOcular 3. Ex vivo – metoda BCOP – test na hovězí rohovce 4. In vivo – pokusné zvíře - albinotický králík

Testy oční dráždivosti a leptavosti In-vitro – Modely lidské kůže EpiOcular Princip testu: trojrozměrný model umělé tkáně EpiOcularTM z lidských keratinocytů kultivovaných do podoby vrstevnatého dlaždicovitého epitelu podobného lidské rohovce zjišťuje se účinek látky na životnost buněk, cytotoxicita je vyjádřena jako redukce aktivity mitochondriální dehydrogenázy Provedení: testovaná látka je umístěna na povrch modelu ve 3 expozičních časech inkubace v 37°C, 5%CO2 inkubátoru v intervalech – 3 min., 30 min., a 60 min) do testu vloženy i tkáně inkubované s pozitivní (Triton X-100) a negativní kontrolou (destilovaná voda)

Testy oční dráždivosti a leptavosti Ex-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability – OECD 437 BCOP je alternativní metoda pro testování oční dráždivosti/žíravosti in-vitro. Účelem zavedení BCOP testovací metody je snaha o redukci množství použitých laboratorních zvířat (králíků) nahrazením jiným testovacím systémem, tj. použití tkání z poraženého hovězího dobytka (ex-vivo). Míra poškození rohovky způsobeného testovanou látkou je vyjádřena kvantitativně IVIS (in vitro irritancy score) pomocí něhož je přiřazena kategorie dráždivosti pro odhad in-vivo očního dráždivého potenciálu testované látky.

Testy oční dráždivosti a leptavosti Ex-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability – OECD 437 Rohovky bez defektů jsou odříznuty (2 až 3 mm prstenec bělimy). Izolované rohovky jsou umístěny do speciálně navržených držáků. Držáky jsou naplněny mediem (EMEM).

Testy oční dráždivosti a leptavosti Ex-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability – OECD 437 Opacita: množství světla prošlého rohovkou (opacitometr), průměrná hodnota opacity Permeabilita: množství fluoresceinu sodného, které proniklo všemi buněčnými vrstvami rohovky. Roztok fluoresceinu (4[l] nebo 5[s] mg/ml) je přidán do přední komory držáku (epithelialní strana rohovky). Koncentrace fluoresceinu, která pronikla do zadní komory (endoteliální strana rohovky) je měřena pomocí UV/VIS spektrofotometru při 490 nm

Testy oční dráždivosti a leptavosti Ex-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability – OECD 437 průměrná hodnota permeability OD490 - IVIS (in vitro irritancy score) IVIS = průměrná hodnota opacity + (15x průměrná hodnota permeability OD490 ) IVIS Klasifikace ≥55,1 Dráždivé nebo žíravé

Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na oči – OECD 405 In vivo test TEST JE PROVÁDĚN V NÁVAZNOSTI NA TEST DRÁŽDIVÉ A LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI provedení testu je možné jen při znalosti účinků testované látky na kůži pozitivní test na kůži – předpoklad pozitivního účinku i na oko (oko citlivější) – netestuje se na zvířatech

Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na oči – OECD 405 In vivo test TESTOVACÍ METODA pokusné zvířa – albinotický králík plemene Novozélandský bílý bez rozlišení pohlaví 24 hodin před aplikací vyšetření obou očí, vážení zvířete dávka – 0,1 ml nebo 0,1 g (zaleží na skupenství) aplikace testovaného materiálu do spojivkového vaku levého oka (pravé oko – kontrola) Počáteční zkouška – 1 zvíře Potvrzující zkouška - 2 zvířata

Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na oči – OECD 405 In vivo test TESTOVACÍ METODA výplach – 24h. po aplikaci testovaného materiálu pozorování oči se vyšetřují po 1, 24, 48 a 72 hodinách oční léze – intenzita (rohovka, duhovka, mžurka, spojivka), vratnost nebo nevratnost změn (pozorování až 21 dní) jiné projevy toxicity (denně) HODNOCENÍ VÝSLEDKU TESTU stupeň vzniku očních lézí na rohovce, duhovce, mžurce, spojivce