Vývoj histologických technik s nahlédnutím do historie Světlana KOPECKÁ 1 Lenka MARTINKOVÁ 2 Hana ŠIMKOVÁ 1 1 Neuropatologická laboratoř Ústavu experimentální neurochirurgie UK LF-HK a FN v Hradci Králové 2 Oddělení patologie, Nemocnice Náchod

Jak se oficiálně etabloval vědní obor “histologie” na české univezitě První docent histologie na české Universitě Karlově: Jan Janošík (1856 – 1927) První histologický ústav na české universitě: založen roku 1889 Jak se oficiálně etabloval vědní obor “histologie” na české univezitě Histologie (z řečtiny histos = tkáň, logos = slovo, nauka)

- v principu se za posledních asi 130 let prakticky nezměnil. Vyobrazení mikroskopu ze druhé poloviny 19. století. Převzato: Ottův naučný slovník; vydání z r. 1901. Klasický mikroskop - v principu se za posledních asi 130 let prakticky nezměnil.

Mikroskop - klíčová podmínka vzniku a rozvoje histologie První složený mikroskop - sestrojen již kolem roku 1590 v Holandsku: Hans Janssen a syn Zacharias; - v Italii roku 1630 - Stelluci, Malpighi. Další zdokonalení - Amici v Modeně na počátku 19. století; - postupně sériová výroba v manufakturách, až po vrcholné propracování, zásluhou Abbého koncem 19. století - Zeissova továrna v Jeně. Badatelské intenzívní využití pro biologické objekty (a zdokonalení): - Holanďan - Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723), - Angličan - Robert Hooke (1635-1703).

Proklamace buněčné teorie – kolem poloviny 19. století Motto: Buňka je elementární součástí těl obou říší: rostlinné a živočišné. Jan Evangelista Purkyně (1787 - 1869) - viz portrét Theodor Schwann (1810 - 1882) Rudolf Ludwig Karl Virchow (1821 - 1902) - zejména v aplikaci na poli celulární patologie, podle principu: “Omnis cellula e cellula” = “Každá buňka pochází z další buňky” Protagonisté

J. E. Purkyně - jako autor zásadních biologicko-medicínských objevů, jakož i průkopník histologických technik Hlavní objevy - mikroskopická stavba kůže - objev kostních buněk, skladba kosti kolem Haversových kanálků - podrobnosti stavby dentinu a skloviny zubní, dentinové kanálky - stavba žaludeční sliznice - buněčná struktura žláz s vnitřní a vnější sekrecí nervové pleteně v mnohých orgánech vlákna převodního systému v srdci - nervová vlákna nejsou dutá, ale obsahují axon - Purkyňovy buňky v CNS Technologický přínos - fixace měkkých tkání - dekalcifikace - výbrusy kostí a zubů - metody řezání preparátů (mikrotom pojmenoval a popsal Purkyňův žák A. Oschatz)

Významný představitel objevů a koncepcí v histologii nervového systému Santiago Ramón y Cajal 1852 - 1934 Snímek z Valencie z roku 1933 Převzato z publikace: J. DeFelipe. TRENDS in Neurosciences, 25 (9): 481-484 (2002). Významný představitel objevů a koncepcí v histologii nervového systému

FIXACE a její prostředky CÍL: zastavení procesu autolýzy, denaturace bílkovin, zachování objemu preparátu. Používané fixační tekutiny: alkohol, kyselina chromová, kyselina pikrová, kyselina octová. Formaldehyd - historické souvislosti: r. 1859 - poprvé jej syntetizoval Alexandr Butlerov (známý ruský chemik); r. 1867 - Hoffman teprve definitivně potvrdil jeho chemickou strukturu; Ottův naučný slovník (vydání z r. 1895) popisuje formaldehyd jako „novum“ v histologii; v poslední čtvrtině 19. století však již jistě používán byl (L. Pasteur, mozky, vzteklina). Sušení tkáně - stará běžná technika pro fixaci a přípravu tkáně ke krájení: r. 1720 Leeuwenhoek; o 150 let později – Altmann vysoušel tkáň v exsikátoru nad kyselinou sírovou; r. 1932 Gersch zkonstruoval lyofilizační aparát; r. 1963 Pearse zavedl termoelektrický kryostat s vysoušením. Kryostat - počátky vývoje: r. 1938 Lang a Morgensen. Historický pohled na jednotlivé kroky histologických technik

ZALÉVÁNÍ První zalévací média: mýdlo, pryskyřice, celoidin, vosk, želatina. r. 1869 Edwin Klebs – vynikající patolog i metodik: metoda zalévání parafínem; dnešní způsob, spojený s „prosycením“ preparátu, byl uplatňován až později; r. 1959 McCormick z Chicaga popsal metodu formace parafinových bločků s použitím plastikového prstence, což byl předchůdce dnešních kazet (formiček); od roku 1966 začíná automatizace různých kroků histologických technik, např. odvodnění (AUTOTECHNIKON, různé systémy tzv. „Tissue-Tek“).

KRÁJENÍ MIKROTOMY: Přístroje (obecně) nazvané podle Purkyněho; rozvoj v polovině 19. století. ruční – v principu dobře nabroušená břitva, zdokonalil ji profesor Toldt; strojové – sáňkové, rotační, zmrazovací.

Ilustrace převzata z knihy: RUČNÍ MIKROTOM Je opatřen mikrometrickým šroubem (dole) pro odměření tlouštky řezu a zařízením pro uchycení preparátu. Ilustrace převzata z knihy: J. Wolf: Mikroskopická technika, nakl. „Vesmír“ s.r.o.; Praha 1940. Str. 305.

Podobnost s dnešním mikrotomem je přinejmenším sugestivní. MIKROTOM ze 2. pol. 19. století. (Převzato: Ottův naučný slovník; vydání z r. 1901.) Podobnost s dnešním mikrotomem je přinejmenším sugestivní.

BARVENÍ - průmyslové kořeny a vlivy na histologii Prehistoricky: Již nejméně 3 tisíce let čítá éra barvení indigem (starověký Egypt). V 19. století je zde evidentní návaznost - a také podmíněnost - s rozvojem v textilním a kožedělném průmyslu. Je také jasná souvislost s objevem principu fotografie a jejím rozvojem (vč. impregnací). Prvním a nejvíce používaným barvivem byl karmín (má několik chemických variant). Klíčový objev anilinových barviv (1856) Henryho Perkina: nejprve pro průmysl a poté i pro mikroskopii se tím otevřela revoluční éra. (To se mimochodem promítlo i do tisku poštovních známek v Britanii za vlády královny Viktorie. Objevitel byl r. 1906 povýšen do šlechtického stavu.) Hematoxylin (znám nejméně od r. 1863) a eosin (dokumentovaně používaný v histologii již kolem roku 1870) - viz další snímek. Trichromová barvení, systematicky používaná od r.1900 (viz dále). BARVENÍ - průmyslové kořeny a vlivy na histologii

a pozdější kombinace s hematoxylinem (H & E): Hematoxylin (HE) První zmínka - 18. století (Reichel). Waldayer (1863) - extrakt ze dřeva (Hematoxylon campechianum). Bohmer (1865) - poprvé publikoval postup barvení. Ehrlich (1886) - aplikoval kyselinu octovou ve směsi. Mayer (1891) - oxidační produkt HE - hematein. 1900 Harris (1900) - kamencový HE. Weigert (železitý HE) - a další barvicí varianty. Eosin (E) a pozdější kombinace s hematoxylinem (H & E): 60. – 70. léta 19. století – barvení eosinem v 1 kroku. Dreschfeld a Fischer – sjednocení H+E do 1 postupu. 1867 - Schwarz rozvinul sekvenční metodu (obě barvy). 1869 - zavedena tzv. diferenciace alkoholem.

Vývoj barvicích kombinací - „TRICHROMY“ Prvé pokusy o kombinace „vícebarevných“ technik již v 80. letech 19. století: Koch v r. 1882 - methylenová modř (alkalická) pro barvení bacilů „tbc“ s dobarvením Bismarckovou hnědí; Ehrlich (1982) toto obměnil za anilin/methylvioleť + methylen. modř. Ziehl (též 1982) nahradil barvení anilinem (výše), a to fenolem s methylvioletí. Neelsen (1983) zaměnil methylvioleť bazickým fuchsinem. (Mimochodem - spolu s Ehrlichem se při bádání nakazili „tbc“, přičemž Neelsen na ni zemřel ve 40 letech, zatímco Ehrlich se vyléčil a ještě dlouho žil). Mallory na poč. 20. století se stal klasikem „trichromu“, podobně jako později Masson. Gram, další z mikrobiologů, použil Lugolův roztok následně po obarvení genciánovou violetí, spíše náhodně, což vedlo ke známému barvení „Gram-pozitivních baktérií“. van Gieson, Leishman, Giemsa, Romanowski, Unna, Pappenheim a jiní pak byli dalšími autory významných modifikací metody na přelomu 19. a 20. století. Další vývoj barvení – zahrnuje např. „kongo-červeň“ (jež má dlouhou historii jako barva pro bavlnu od r. 1884), ale dalších téměř 50 let obohacovala histologii (axony, amyloid). Vývoj sofistikovanějších metod pokračoval až do poloviny 20. století - Gömöri, Steedman, Kluver, Barrera a další…

Elektronový mikroskop 1924 Busch – prokázal možnost fokusace svazku elektronů magnetickým polem; 1931 Ruska a Knoll - zkonstruovali první elektronový mikroskop. Enzymová histochemie – průkaz přítomnosti a aktivity enzymů ve tkáni po počátcích v 1. pol. 20. století bouřlivý rozvoj v 60. letech (nárůst o stovky enzymů); výrazný příspěvek (mezi mnoha jinými badateli) je od prof. MUDr. Z. Lojdy; dnes této technice (vědecky i diagnosticky) značně konkuruje imunohistochemie. Imunohistochemie - průkaz antigenu pomocí protilátky (a jejího značení) 1941 – Coons se spol. poprvé konjugovali a použili protilátku s fluoresceinem (FITC); 1950, 1955 – identifikace antigenu ve tkáni, spolu s rozvojem fluorescenční mikroskopie. První použití enzymu (křenové peroxidasy) a substrátu, jako techniky pro značení protilátek s cílem vizualizace – 1966 Nakane a Pierce a zároveň Avremeas a Uriel). Od 70. let –zavedení (zejména Avremeas se spol.) dalších enzymů do techniky IHC, jako jsou nyní často užívané: alkalická fosfatasa, beta-galaktosidasa, glukosaoxidasa. 1975 – počátek revoluční éry s použitím monoklonálních protilátek v oboru IHC: přináší standardizaci protilátky prakticky na úrovni definované „chemikálie“. Molekulární genetika – aplikace metod v histologii - SOUČASNOST „In situ“ hybridizace (ISH), založená na interakci definované „sondy“ s DNA; varianty detekce při ISH: simultánní autoradiografie nebo fluorescence (mFISH). DALŠÍ ETAPY ROZVOJE

Hradec Králové, Staré náměstí D Ě K U J I Z A P O Z O R N O S T Dík patří: prof. MUDr. Z. Nožičkovi, DrSc, a doc. MUDr. J. Cermanovi, CSc., za pomoc s historickými literárními prameny a za kritické připomínky k textu. Studie byla vytvořena za podpory Výzkumného záměru MSM 0021620820, MŠMT České republiky. Hradec Králové, Staré náměstí