Terapeutické vakcíny - nové poznatky Oddělení experimentální virologie Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha Terapeutické vakcíny - nové poznatky Michal Šmahel

Terapeutické vakcíny proti HPV??? + částečné pokrytí populace vakcinací + typy HPV neobsažené ve vakcíně + proklouznutí imunizaci + nádory u již infikovaných se objeví za několik let

terapeutických vakcín??? Pokroky ve vývoji terapeutických vakcín??? účinnost imunizace ZLEPŠENÍ JAK? účinek v klinických zkouškách NIC - MOC PROČ?

Východiska, předpoklady  častá spontánní regrese  imunitní buňky v regredujících lézích  cirkulujicí specificky stimulované imunitní buňky  zvýšený výskyt nádorů při poruše imunity Virové proteiny = nádorové antigeny

Infekce HPV regrese progrese maligní nádor 99% 1% persistentní infekce genet. predispozice kofaktory prostředí únik imunitě hostitele maligní nádor

HPV – evolučně staré mechanismy úniku imunitě replikační strategie HPV aktivní tlumení imunity

Replikační strategie HPV  infekce bazálních keratinocytů, ne APC  nelyzují hostitelské buňky  bez viremie (nedostávají se do krve)  časné antigeny hlavně jádře  produkce pozdních antigenů minimalizována  vyvolání tolerance expozicí antigenů v nezánětlivém prostředí

Utlumení funkce interferonů E6 - vazba na transkripční faktor IRF-3  zabránění aktivace tvorby IFN-α,β - vazba na Tyk2  inhibice signálů vyvolaných IFN-α E7 - vazba na transkripční faktor IRF-1  zabránění aktivace tvorby IFN-β E6,E7 - po uvolnění z buněk snižují tvorbu IFN-γ v buňkách NK

Rozpoznání nádorové buňky lymfocyty Tc tumor cell

Zpracování antigenu a prezentace pomocí MHC-I endoplasmatic reticulum 2m MHC-I Golgi apparatus TAP-1 TAP-2 proteasome peptides transport vesicle LMP-2 LMP-7

Vliv HPV na prezentaci antigenů E5  inhibice tvorby MHC I. třídy  inhibice přesunu MHC-I na povrch E7  inhibice promotoru MHC-I  inhibice promotoru LMP-2/TAP-1

Hlavní únikové mechanismy nádorů  snížení exprese MHC I. třídy  snížení produkce nádorového antigenu  změna sekrece imunomodulačních faktorů  zvýšená odolnost k apoptose

hromadění mutací maligní buňky unikající imunitě onkoprotein E6 inaktivuje p53 nestabilita genomu premaligních buněk hromadění mutací imunitní dozor maligní buňky unikající imunitě

Terapeutické HPV vakcíny Cíl: buněčná imunita proti nestrukturálním antigenům  E1, E2 - v počátcích infekce - po integraci často zrušeny  E6, E7 - onkogeny - přítomny stále

Strategie terapeutických vakcín Peptidové/proteinové vakcíny DNA/RNA vakcíny Vakcíny využívající živých vektorů Buněčné vakcíny Rostlinné vakcíny

Peptidové vakcíny

Proteinové vakcíny Izolované proteiny (z bakterií) E7GST/algammulin TA-GW (HPV6 L2-E7) - Xenova TA-CIN (HPV16 L2-E6-E7) - Xenova HspE7 – Stressgen E6E7-IMX – CSL Ltd. PD-E7/AS02 - GSK

DNA vakcíny „Nahá“ nebo v komplexu - s polymery - s lipidy Problémy s E6 a E7: - onkogennost - malá imunogennost

Onkogennost E6 a E7 Možnosti řešení:  kousky genu kodující epitopy  promíchaný gen  mutovaný gen

PROTEIN E7GGG 37/38 AA 1 15/16 98 TG21LYG24YG26Q E7GGG HPV16 E7 Konzervovaná oblast 1 Konzervovaná oblast 2 Doména vázající zinek C-X-X-C C-X-X-C vazba na pRB CK II 37/38 AA 1 15/16 98 TG21LYG24YG26Q E7GGG HPV16 E7 TD21LYC24 YE26Q

Promíchaný (shuffled) E7 Osen et al., Vaccine. 2001 Jul 20;19(30):4276-86

Imunogennost E6 a E7 Možnosti zvýšení  modifikace genu - změna sekvence epitopů - změna stability proteinu - změna zastoupení kodónů  konstrukce fúzních genů

Fúzní geny Mechanismy účinku:  změna buněčné lokalizace  nasměrování do dráhy MHC-I  nasměrování do dráhy MHC-II  přenos mezi buňkami  zvýšení degradace proteinu  dodání pomocných epitopů

PROTEIN Sig/E7/LAMP-1 HPV16 E71-98 Wu et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11671-11675, 1995 Lysosome-associated membrane protein 1 (LAMP-1) Signální peptid HPV16 E71-98 Tyr-Gln-Thr-Ile 29/30 127/128 167 AA 1 endoplazmatické retikulum endozomy lysozomy

Zvýšení účinnosti DNA vakcín  Adjuvans  Způsob aplikace  Geny pro imunostimulační molekuly  Prodloužení přežívání DC  Kombinace s jiným typem vakcíny (heterologní „prime-boost“)

Klinické zkoušky DNA vakcín ZYC101 - Zycos - HPV16 E6 a E7 - enkapsulovaná plasmid. DNA [poly (lactide-co-glycolide)]

Živé vakcínové vektory Bakterie Listeria monocytogenes Salmonella BCG Viry Virus vakcinie Adenoviry Adeno-asociované parvoviry (AAV) Alfaviry

Klinické zkoušky rVV Heterologní prime-boost TA-HPV (HPV16/18 E6/E7) – Xenova HPV16 E2 – Mexico MVA-HPV-IL2 (HPV16 E6,E7) - Transgene Heterologní prime-boost TA-HPV (rVV) + TA-CIN (protein)

Varianty HPV v genu E6 Selektované pod tlakem imunitního dozoru  snížení prezentace antigenů KORELACE SE ZVÝŠENOU ONKOGENNOSTÍ R10G - v epitopu HLA-B7 - zvýšený výskyt u pacientů s HLA-B7 L83V - v epitopu HLA-B44 - výskyt spojen s progresí nádorů

Příprava imunorezistentních klonů TC-1 Imunizace myší proti antigenu E7 DNA vakcínou Podkožní podání nádorových buněk TC-1 Odvození buněčných linií z nádorů Klonování linií in vitro

Imunosenzitivita klonů z nádoru TC-1 Buněčná linie pBSC E7GGG.GUS TC-1/E7GGG 5/5 0/5 TC-1/B7 5/5 0/5 TC-1/C6 5/5 5/5 TC-1/F9 5/5 5/5 TC-1/C1 5/5 0/5 TC-1/E4 5/5 5/5 TC-1/B6 5/5 5/5

Sekvenace E7 v klonech TC-1 TC-1/C6 N53S

Predikce vazby peptidu na MHC-I H2-Db score RAHYNIVTF 82 RAHYSIVTF 49 Binding threshold: 53

Současnost Infekce HPV imunita únik progrese regrese premaligní léze maligní Tu vakcinace regrese progrese regrese progrese

Budoucnost? Infekce HPV imunita únik progrese regrese premaligní léze maligní Tu chemo+imuno regrese progrese regrese progrese