Metodika přípravy medií obecně 1/ Příprava zásobních roztoků RR (1mg - 1  mol - 1 ml) makroelementy (10x) - kromě Ca mikroelementy (100x), příp. 2x ředit FeEDTA vitaminy ( x) (2-3 měs 2-4 °C, déle při -20°C) Komerčně dostupné

koncentrace Váhové jednotky = 1mg.l -1 (ppm) Molární koncentrace 1M = MW v g v 1litru roztoku (1mM = v mg/l, 1  M = v  g/l)

Převod mM na mg: MW 2,4-D = 221,0 1mM 2,4-D ……221mg/l 1  M 2,4-D …….0,221 mg/l mg/l na mM koncentrace v mg/l MW 1  M = 1  mol.l -1

Rozpouštění RR 2,4-D, IAA - 96%ETOH nebo 1N KOH CK - 1N KOH nebo HCl TDZ - DMSO (dimetylsulfoxid)

2/ odměření jednotlivých zásobních roztoků podle receptury (navážení komerční směsi) 3/ přidání sacharozy 4/ rozmíchání 5/ doplnění vody do 3/5 celk. objemu 6/ změření a upravení pH na mag. míchačce (1N HCl a 1N KOH) 7/ přidat rozehřátý agar (rezerva objemu) 8/ doplnit horkou vodou do celk. objemu 9/ rozlít do kultivačních nádob 10/ zakrýt pečlivě víčkem, případně popsat 11/ sterilizovat v autoklávu

Modifikace - termolabilní substance (nebo Gelrit) 1-6 stejné, s vyjímkou termolabilních látek sterilizujeme celé medium v autoklávu (objemová rezerva) v cejchované nádobě; kult. nádoby zvlášť necháme vychladnout ve flowboxu cca 50°C mezitím zfiltrujeme termolabilní látky přes filtr 0,2  m přidáme do chladnoucího media (40-50°C) dobře rozmícháme a doplníme sterilní dest. vodou rozlijeme do předem vysterilizovaných nádob

Termolabilní substance* Fruktóza, maltóza Ca-pantothenát gibereliny, IAA, ABA riboflavin, k.listová močovina asparagin, glutamin adenin sulfát enzymy antibiotika pro přesné pokusy všechny vitamíny, aminokyseliny i RR

Dotazy?

? Pokračovat v teorii ?

Způsoby kultivace rostlinných pletiv a buněk

stacionární (můstky, buničitá vata, čedičová vata, polyuretanová pěna, membrány apod.) provzdušňovaná - třepačky - klinostaty - míchaná - probublávaná

Kultivační nádoby Magenta (Sigma)

VitroVent

Inkubovaná třepačka Amplituda otáčky (rpm)

Kultivační láhev s míchadlem Pro suspenzní kultury rpm 1-12 litrů (Techne, Sigma)

Roller Pomalé šetrné otáčení 5-60 revolution per hour (do 1 rpm) jen pro buňky, ulpívající na stěnách nádoby

Kromě chemických podmínek – média Důležité i plynné prostředí (etylén, CO 2, H 2 O) Fyzikální podmínky teplota světlo

Způsoby regenerace in vitro, orgánové kultury – přímá a nepřímá organogeneze Přímá organogeneze - využití: rychlé namnožení cenných genotypů (podstatné zvýšení množitelského koeficientu, množení těžko množitelných kultur, cenných jedinců, vzácných druhů)

příklady Brambory klasicky 1: mikropropagace 1: rododendrony apod. Vzdálená křížení, nedávající plodné potomstvo šlechtitelsky cenné mutace

Způsoby regenerace in vitro, orgánové kultury – přímá a nepřímá organogeneze Nepřímá organogeneze - využití: selekce (selekční tlak, využití somaklonální variability, mutageneze, transgenoze)

4/ Způsoby hodnocení a dokumentace kultur Počet kontaminovaných/ rostoucích/nerostoucích kultur Měření přírůstku prýtů, kořenů, kalusu vážení - nárůst hmotnosti počítání (regenerovaných prýtů, buněk) V různém časovém odstupu