Familiární hyperbilirubinémie Milan Jirsa Laboratoř Experimentální Hepatologie CEM IKEM Praha

Degradace hemu, typy žloutenek Převážně nekonjugovaná (premikrosomální typ) Převážně konjugovaná (postmikrosomální typ)

Familiární nekonjugované hyperbilirubinémie Familiární hyperbilirubinémie Gilbertova typu Crigler-Najjarův syndrom I. typu Familiární konjugované hyperbilirubinémie Dubin-Johnsonův syndrom Rotorův syndrom

Mikrosomální konjugační aparát Bilirubin UDPG glukosiduronát transferáza

Benigní hyperbilirubinémie Gilbertova typu Autosomálně recesívně nědičná benigní metabolická odchylka postihující 5-10% populace Familiární žloutenka, často jen ikterus sklér, zhoršení při stresu, hladovění a fyzické námaze Někdy v anamnéze protrahovaná novorozenecká žloutenka Hodnoty sérového bilirubinu do 100 mmol/l Zpomalená clearance nepřímého bilirubinu Veškeré další laboratorní nálezy opakovaně v normě

Benigní hyperbilirubinémie Gilbertova typu Diagnóza: per exclusionem bez použití invazívních vyšetřovacích metod Léčba: není třeba Prognóza: pravděpodobně lepší než normální populace (Vítek L., Jirsa M. et al., Atherosclerosis 160, 2002, 449-56)

Crigler-Najjarův syndrom I. Typ: Autosomálně recesívně dědičná fatální novorozenecká převážně nekonjugovaná žloutenka Hodnoty sérového bilirubinu bez léčby 350 – 650 mmol/l Ostatní laboratorní nálezy v mezích normy Úmrtí v raném věku následkem poškození CNS II. Typ (Ariasův syndrom): Autosomálně recesívně dědičná závažná novorozenecká převážně nekonjugovaná žloutenka Hodnoty sérového bilirubinu bez léčby 100 – 350 mmol/l Ostatní laboratorní nálezy v mezích normy

Crigler-Najjarův syndrom Diagnóza: u I. typu jasná již v novorozeneckém věku, II. typ může diagnóze uniknout (Vítek L, Bosma P, de Boer A, Jirsa M et al., Čas Lék Česk 135, 1996, 114-116) Léčba: u I. typu intenzívní fototerapie, transplantace jater v dětském věku, zkouší se transplantace hepatocytů a genoterapie, u II. typu v raném dětském věku fototerapie, později bez léčby Prognóza: u I. typu špatná, u II. typu po překonání kritického období v dětském věku dobrá

Příčina familiárních nekonjugovaných hyperbilirubinémií: Defekt v genu UGT1A1 nebo v jeho promotoru

Uspořádání UGT1A lokusu Lokus na 2q37 obsahuje 13 genů rodiny UGT1A

Mutace v genu UGT1A1 vyvolávající Crigler-Najjarův syndrom 37 17 Kadakol et al., 2000

TATA box v promotoru UGT1A1 Začátek transkripce tgccatatatatatatataagtaggagagggcgaacctctggcaggagcaaaggcgccatgGCT TATA box 1.exon

Dubin-Johnsonův syndrom Familiární převážně konjugovaná hyperbilirubinémie Hepatomegalie Ukládání lysosomálního pigmentu příbuzného melaninu v hepatocytech Koproporfyrinurie s převahou izomeru I Zpomalené vylučování bromsulfoftaleinu, indocyaninové zeleně a dalších barviv aniontové povahy Ostatní laboratorní nálezy v mezích normy

ABCC2/MRP2/cMOAT Kanalikulární transportér pro konjugovaný bilirubin, glukosiduronáty, sulfáty a jiné multivalentní organické anionty Exprimovaný v apikální membráně hepatocytů a enterocytů v duodenu a v proximálním jejunu Upraveno podle Kullak-Ublick et al., J.Hepatol. 2000

Gen ABCC2/MRP2/cMOAT Tsuji et al., Gastroenterology 1999 je lokalizovaný na 10q24 (45 kb) a sestává ze 32 exonů kóduje ABC transportér o MW 190 kDa

ABCC2 a mutace v tomto genu popsané u nemocných s Dubin-Johnsonovým syndromem Upraveno podle Toh et al., Am.J.Hum.Genet. 1999

Rotorův syndrom Familiární převážně konjugovaná hyperbilirubinémie Koproporfyrinurie s převahou izomeru I Zpomalené vylučování bromsulfoftaleinu, indocyaninové zeleně a dalších barviv aniontové povahy Ostatní laboratorní nálezy v mezích normy Na rozdíl od Dubin-Johnsonova syndromu chybí lysosomální pigment v hepatocytech

Pracovní hypotéza: Rotorův syndrom je vyvolán dosud neznámou mutací v genu ABCC2/MRP2/cMOAT nebo v jeho promotoru

Pacient F.J. – anamnéza RA: OA, NO: Rodiče žloutenku nikdy neměli, 4 zdravé sestry, dcera v.s. Gilbertův syndrom OA, NO: Od narození ikterus sklér Intermitentní žloutenka při chřipce či fyzické námaze V 7 letech hospitalizován pro žloutenku (st.p. hepatitidě?) V 18 letech hospitalizován pro žloutenku, neodveden Před 5 lety hosp. pro embolii a. centralis retinae, zjištěna konjugovaná hyperbilirubinémie, hodnoty trvale okolo 150 mmol/l Od té doby trvale ikterický

Pacient F.J. – lab. nálezy, USG a ERCP Převážně konjugovaná hyperbilirubinémie Všechna ostatní běžná vyšetření v normě (KO, JT + další biochemické testy včetně vyšetření žlučových kyselin v séru, imunologie, screening na hemolýzu aj.) Intermitentně mírně zvýšený odpad porfyrinů (max. 502 mg / 24hodin), chromatograficky výlučně koproporfyrin, z toho 2/3 izomer I, 1/3 izomer III USG jater a žluč. cest bez patol. nálezu ERCP bez patol. nálezu Chromatografie izomerů koproporfyrinu v moči

Pacient F.J. – cholescintigrafie zdravý jedinec Závěr: Ojedinělý nález extrémně závažné poruchy chromoexkrečních funkcí jater (prim. MUDr. J. Urbánek, Ústav nukleární medicíny VFN Praha)

Pacient F.J. – histologické vyšetření Hematoxylin & Eosin, zvětšeno 150 x Vzorek jaterní tkáně (cetrozonální oblast) s normální histologií a cytologií. Nápadná je absence lipopigmentu v hepatocytech.

Pacient F.J. – imunohistochemické vyšetření ABCC2/MRP2/cMOAT v játrech Protilátka M2III-6, zvětšeno 150 x C F.J. Vzorky jaterní tkáně z pacienta s minimální hepatopatií bez cholestázy (C) a pacienta F.J. V obou případech je imunohistochemicky prokazatelná přítomnost ABCC2 na biliárním pólu hepatocytů.

Pacient F.J. – určení sekvence ABCC2 z genomové DNA Izolace genomové DNA z periferních leukocytů ß PCR amplifikace jednotlivých exonů Agarosová elektroforéza Izolace produktů z gelu Sekvenační PCR s univerzálními značenými primery Sekvenování

Pacient F.J. – určení sekvence ABCC2 z genomové DNA

Pacient F.J. – heterozygotní synonymní polymorfismus v exonu 28 3972T+C(I1324I) ę 1324 Isoleucin

Promotor ABCC2/MRP2 Postup Úvod Oblast –517 až –197 je rozhodující pro bazální transkripci a vazbu pro játra specifických transkripčních faktorů AP1, SP1, HNF1, HNF3b Proximální promotor (cca 1200 bp) je zodpovědný za expresi ABCC2 stimulovanou dimery FXR, PXR a CAR s RXR Žádná mutace v oblasti promotoru ABCC2 asociovaná s hyperbilirubinémii není známa Postup Metodou PCR byly z gDNA amplifikovány 3 fragmenty pokrývající 1824 bp promotoru Sekvenováním bylo zjištěno pořadí bází -1 až -1607

Pacient F.J. – heterozygotní polymorfismus v promotoru ABCC2/MRP2 G-995G+A ę Význam: nejspíš žádný, polymorfismus nalezen u 16% kontrol

Závěr Vrozená hyperbilirubinémie u našeho nemocného není podmíněna žádnou z dosud známých mutací v genu ABCC2/MRP2/cMOAT V genomové DNA jsme nenalezli žádnou mutaci v ABCC2, která by vysvětlovala fenotyp onemocnění Další postup Sekvenovat cDNA s cílem vyloučit rozsáhlé delece a zjistit expresi obou alel na úrovni transkripce Upřesnit lokalizaci ABCC2 v hepatocytech konfokální mikroskopií (defekt radixinu?) Vyšetřit expresi MRP3 (defekt mikrosomální X-glukosiduronát translokázy?)

Mikrosomální konjugační systém X-glukosidutonát translokáza

Složení žluče Podle Carey MC, Cahalane MJ: Enterohepatic circulation. In: Arias IM, Jakoby WB, Popper H, Schachter D, Schafritz DA, editors. The liver: biology and pathobiology. Raven Press New York 1988, 573-616.

Kanalikulární transportéry Lipid droplets: CE storage NPC? ER: synthesis LDL LDL-R ACAT2 BSEP BS endolysomal pathway HDL NPC? SR-B1 FC NCEH GOLGI MDR3 PC CYP7A1 FC CE ? ABCG5/G8 FC SCP-2 peroxisomes TGN ABCC2/MRP2 bilirubin CE VLDL

choroba vyvolaná jeho defektem Defekty v genech kódujících kanalikulárních transportéry a jejich následky transportér choroba vyvolaná jeho defektem ABCB11/BSEP PFIC2 = progresívní familiární intrahepatální cholestáza 2. typu ABCB4/MDR3 PFIC3 Cholestatická cirhóza mladistvých Intrahepatální pozdně těhotenská cholestáza (ICP) Familiární cholelitiáza ABCG5/G8 Sitosterolémie ABCC2/MRP2 Dubin-Johnsonův syndrom Rotorův syndrom? ATP8B1/FIC1 PFIC1 = Bylerova choroba Grónská familiární cholestáza BRIC = benigní rekurentní intrahepatální cholestáza

Benigní rekurentní intrahepatální cholestáza (BRIC, syndrom Summerskill- Walsheův) Autosomálně recesívní intrahepatální cholestáza Ataky žloutenky provázené úporným svěděním a přechodnou hepatomegalií První ataka obvykle do konce 2. dekády, trvání ataky týdny až řadu měsíců, počet atak 1 až 30 za život Laboratorně hyperbilirubinémie, zvýšená aktivita ALP a koncentrace a sérových žluč. kyselin, normální S-GMT a cholesterol Prognóza většinou dobrá, asi 6% progreduje v cirhózu

Protein ATP8B1/FIC1 Exprimovaný v apikální membráně hepatocytů, enterocytů v distálním ileu, acinárních buněk pankreatu, nízká exprese v řadě dalších tkání Funkce neznámá, hypotézy: flipáza membránových fosfolipidů transportér hydrofobních žlučových kyselin iontový kanál

Gen ATP8B1/FIC1 je lokalizovaný na 18q21, zaujímá 98kb sestává z 27 exonů kóduje ATPasu o MW 140 kDa

Mutace v genu ATP8B1/FIC1 asociované s BRIC exon důsledek citace T1982C 17 I661T Bull 1998 CT2286-4AA ? 2384del9 20 795delGNR Splice site 24 Skipped exon van Ooteghem 2002

Pacient M.K. – anamnéza RA: negativní OA, NO: Nar. 1972, protrahovaná novorozenecká žloutenka V 10 měsících žloutenka po varicele, závěr nejasný, léčba kortikoidy 1975 2měsíční ataka žloutenky 1976 roční ataka, chir. revize žluč. cest: bez patol. nálezu 1990 po sinusitidě další ataka, vyloučena IHE, nor. ERCP, závěr nejasný, opět léčen kortikoidy 1990-98 3x jaterní biopsie 1998 další ataka, hosp. na Ústavu klin. Imunologie LFHK

Pacient M.K. – lab. nálezy, USG a ERCP FW 50/86 KO: anémie, leuko 12 Hyperbilirubinémie, ALP 14,4 mkat/l, celk. žluč. kyseliny 220 mmol/l GMT opakovaně normální Fe, transferin, Cu, ceruloplasmin, alfa1-AT v normě Imunologická vyšetření v normě USG jater a žluč. cest bez patol. nálezu ERCP bez patol. nálezu 4. jaterní biopsie: intrahepatální cholestáza bez známek přestavby

Pacient M.K. – určení sekvence ATP8B1 z genomové DNA Izolace genomové DNA z periferních leukocytů ß PCR amplifikace jednotlivých exonů Agarosová elektroforéza Izolace produktů z gelu Sekvenační PCR s univerzálními značenými primery Sekvenování

Pacient M.K. – heterozygotní bodová mutace v 17. exonu ATP8B1 T1982T+C ę Tsp509I Tsp509I ...GCTACAAGGAAAtTGAAGAAAAAGAATTTACA... ...CGATGTTCCTTTAACTTCTTTTTCTTAAATGT... 95 bp 14 bp M.K. kontrola

Pacient M.K. – heterozygotní delece ve 24. exonu ATP8B1 del3122TCCTA ę Mutovaná alela: G G G G A C A T C G A T G … Normální alela : G G G G T C C T A A C A T …

Pacient M.K. – heterozygotní delece ve 24. exonu ATP8B1 Restrikční analýza EcoO109I ...TTGTAAGCTTGTTGCATGGGGTCCTAACATCGATGATCCTCTTCTTCATA... ...AACATTCGAACAACGTACCCCAGGATTGTAGCTACTAGGAGAAGAAGTAT... 715 bp 220 bp

Pacient M.K. – vyšetření rodiny Restrikční analýza mutace v 17. exonu Restrikční analýza mutace v 24. exonu MK

Závěr Studovaný nemocný je složený heterozygot pro dvě různé mutace v genu ATP8B1/FIC1 Bodová mutace T1982C (I661T) je známá mutace asociovaná s fenotypem BRIC Delece del3122TCCTA je dosud nepopsaná mutace, jejímž důsledkem je posunutí čtecího rámce, záměna většiny ze 73 aminokyselin a předčasné ukončení transkripce (stop kodon v pozici 1113 místo 1252) Další postup Určit sekvenci obou alel 24. exonu z klonovaných fragmentů genomové DNA Vyšetřit expresi mutované alely u matky a bratra

Poděkování IKEM Praha: L. Budišová P. Taimr S. Hejtmánková Ústav dědičných metabolických poruch UK 1.LF Praha: M. Hřebíček L. Dvořáková M. Elleder Ústav klinické biochemie UK 1.LF Praha: L. Vítek I. interní klinika UK 1.LF a VFN Praha: M. Brodanová Ústav klinické imunologie a alergologie UK LF Hradec Králové: P. Wurm I. interní klinika UK LF Hradec Králové: P. Hůlek

? Máte v péči nemocné s chronickou cholestázou či s vysokou (>100mmol/l) hyperbilirubinémií nejasné etiologie? Nabízíme možnost jejich genetického vyšetření. Kontakt: MUDr. Mgr. Milan Jirsa, CSc. Laboratoř experimentální hepatologie IKEM e-mail: Milan.Jirsa@medicon.cz