Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA Lucie Navrátilová 2. ročník MBB PřF UP v Olomouci 2007/2008

určení diagnózy co nejdříve medicína hledá rychlý, snadný a levný způsob identifikace bakterií

Bakterie nejjednodušší jednobuněčné organismy, viditelné pod mikroskopem patogenní X nepatogenní

DNA (deoxyribonukleová kyselina) nosič genetické informace v podobě sekvencí nukleotidů podle rozdílností mezi geny se dají organismy identifikovat GEN = sekvence nukleotidů s biologickou funkcí

Identifikace určení izolovaného mikroba souboru znaků mikroba porovnává se znaky identifikační maticí

Broad-range PCR-HRMA

PCR (Polymerase Chain Reaction) biochemická reakce využívá DNA-polymerázy ke klonování DNA DENATURACE (94-96°C) NASEDÁNÍ PRIMERŮ (cca 53°C) EXTENZE (72°C)

HRMA (High-Resolution Melting Analysis) identifikace bakterií na základě odlišností mezi tt jejich DNA Tm = melting temperature

Příklad zvolený gen leží v úseku 16S rDNA zkoumané druhy bakterií: Burkholderia cepacia pickettii Pseudomonas aeruginosa Stenotrophomonas malthophilia

Burkholderia cepacia http://www.wickipedia.cz

Pseudomonas aeruginosa http://www.wickipedia.cz

Stenotrophomonas maltophilia http://www.wickipedia.cz

PCR směs pro 1 reakci LCGreen 2 destilovaná voda 14,24 μl DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1 rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR oleje

PCR směs pro 1 reakci LCGreen 2 destilovaná voda 14,24 μl DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1 rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR oleje

PCR směs pro 1 reakci primer F 0,1 primer R 0,1 destilovaná voda 14,24 μl LCGreen 2 DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1 rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR oleje

PCR směs pro 1 reakci Taq-polymeráza 0,4 destilovaná voda 14,24 μl LCGreen 2 DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1 rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR oleje

PCR směs pro 1 reakci destilovaná voda 14,24 μl LCGreen 2 DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1 rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR oleje

Obr.2: Aparatura pro PCR-HRMA Obr.3: RotorGene

DNA 5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’ 3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

Denaturace DNA 5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’ 3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

Nasedání primerů 5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’ 3’-CTAATATC-5’ 5’-GCGATTAG-3’ 3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

Extenze primerů 5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’ 3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGG3’-CTAATATC-5’ 5’-GCGATTAG-3’ GCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’ 3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

Graf 1: Normalizovaný graf denaturované DNA fluorescence - normalizovaná teplota °C

Graf 2: Normalizovaný graf denaturované DNA fluorescence - normalizovaná teplota °C

Použitá literatura deSilva D., Blackett J.,High-Resolution melting & Unlabeled probes Developing a Simple and Inexpensive Genotyping Assay with Lunaprobes, Genetic Engineering & biotechnology News, 27, publish on-line: http://www.genengnews.com/articles/chtitem.aspx?tid=1986&chid=1 Votava M., Lékařská mikrobiologie - obecná, Neptun, 2005

Děkuji za pozornost!