Imunogenní smrt nádorových buněk indukovaná HPMA konjugáty. Lubomír Kovář Mikrobiologický ústav AVČR v.v.i. Vídeňská 1083, Praha 4-Krč

Imunogenní vs. neimunogenní apoptóza 33 Apoptóza Imunogenní Neimunogenní

Imunogenní vs. neimunogenní apoptóza Obeid, Nat Med. 2007 Apetoh, Nat Med. 2007 Špíšek, Blood. 2007 56 Apoptóza Imunogenní Neimunogení

Imunogenní vs. neimunogenní apoptóza Obeid, Nat Med. 2007 Apetoh, Nat Med. 2007 Špíšek, Blood. 2007 1 00 Apoptóza Imunogenní Neimunogen

Imunogenní vs. neimunogenní apoptóza 1 07 Etoposide Mitomycin C Anthracyclines Obeid et al. 2007

Molekulární mechanismy imunogenní apoptózy 1 26 Apoptóza Molekulární mechanismy Zitvogel et al. 2008

HPMA konjugáty Dox-HPMAAM Dox-HPMAHYD 2 12 Dox-HPMA HPMA Konjugáty Dox=doxorubicin; HPMA=N-(2-hydroxypropyl)metakrylamid

Protinádorová imunita indukovaná HPMA konjugáty Retransplantace myší vyléčených konjugátem Dox-HPMAHYD. 2 42 Protinádorová imunita Retransplatace Dox-HPMAHYD (1 x 25 mg Dox. eq./kg) Dox-HPMAHYD (1 x 75 mg Dox. eq./kg) volný doxorubicin (3 x 6 mg/kg) kontrola Říhová et al, Trends Biotechnol. 2009 27:11-7

Protinádorová imunita indukovaná HPMA konjugáty Retransplantace myší vyléčených konjugáty Dox-HPMAAM a Dox-HPMAAM-HuIg. 2 51 Dox-HPMAAM Dox-HPMAAM-HuIg kontrola Říhová et al, Trends Biotechnol. 2009 27:11-7

Imunogenní apoptóza – kalretikulin (CRT) Plazmatická membrána CRT ERp57 CD47 β-actin Buněčný lyzát Kontrola Dox Dox-HPMAHYD Dox-HPMAAM Dox-HPMA-HuIgAM 3 25 Imunogenní apoptóza Kalretikulin CRT

Imunogenní apoptóza – kalreticulin (CRT) p-eIF2a; 3h p-eIF2a; 5h eIF2α Kontrola Dox Dox-HPMAHYD Dox-HPMAAM Dox-HPMA-HuIgAM 4 37

Imunogenní apoptóza – kalreticulin (CRT) 5 00 Přerušovaná čára ukazuje míru exprese kalretikulinu po inkubaci buněk s konjugátem Dox-HPMAAM.

Imunogenní apoptóza – heat shock proteins (HSP) 5 19 Imunogenní poptóza Heat shock proteins HSP

Imunogenní apoptóza – heat shock proteins (HSP) 5 39

Imunogenní apoptóza – HMGB1 Uvolňování High-mobility-group box 1 (HMGB1) proteinu z EL4 buněk. HMGB1, supernatant, 24h HMGB1, supernatant,72h β-aktin, supernatant, 72h HMGB 1, lyzát, 72h Kontrola Dox Dox-HPMAHYD Dox-HPMAAM Dox-HPMA-HuIgAM 5 49 Imunogenní apoptóza HMGB1

In vitro fagocytóza nádorových buněk Dox-HPMAAM-HuIg Kontrola Doxorubicin Dox-HPMAHYD Dox-HPMAAM Hoechst 33258 24h 24h; aCRT CFSE Gated on CD11c+ dendritic cells 6 15 Fagocytóza In vitro Nádorové buňky

In vivo fagocytóza nádorových buněk CD8α PBS Kontrola Doxorubicin Dox-HPMAHYD Dox-HPMAAM Dox-HPMAAM-HuIg CFSE 7 00 Fagocytóza In vivo Nádorové buňky Gated on CD11c+ dendritic cells

In vitro fagocytóza nádorových a nenádorových buněk 7 13 Fagocytóza In vitro Nenádorové buňky

In vivo indukce protinádorové odpovědi (Winnův test) 7 34 Winnův test Indukce In vivo

Závěr 9 00

Závěr · Volný a hydrazonově vázaný doxorubicin stimulují expresi kalretikulinu a HSPs a uvolnění HMGB1. 9 12

Závěr · Volný a hydrazonově vázaný doxorubicin stimulují expresi kalretikulinu a HSPs a uvolnění HMGB1. · Amidicky vázaný doxorubicin stimuluje jen expresi HSPs. 9 17

Závěr · Volný a hydrazonově vázaný doxorubicin stimulují expresi kalretikulinu a HSPs a uvolnění HMGB1. · Amidicky vázaný doxorubicin stimuluje jen expresi HSPs. · Nádorové buňky inkubované s volným, hydrazonově i amidicky vázaným doxorubicinem jsou fagocytovány dendritickými buňky. 9 24

Závěr · Volný a hydrazonově vázaný doxorubicin stimulují expresi kalretikulinu a HSPs a uvolnění HMGB1. · Amidicky vázaný doxorubicin stimuluje jen expresi HSPs. · Nádorové buňky inkubované s volným, hydrazonově i amidicky vázaným doxorubicinem jsou fagocytovány dendritickými buňky. · HPMA vázaný doxorubicin je lepší stimulátor protinádorové imunity než volný 9 29

Závěr Volný doxorubicin HPMA vázaný doxorubicin 9 33

Závěr Volný doxorubicin lepší stimulátor imunogenní apoptózy in vitro HPMA vázaný doxorubicin 9 39

Závěr Volný doxorubicin lepší stimulátor imunogenní apoptózy in vitro HPMA vázaný doxorubicin lepší induktor protinádorové imunity in vivo 9 48

makromolekulární chemie AVČR, v.v.i. Mikrobiologický ústav Karel Ulbrich Tomáš Etrych Dana Plocová Petr Chytil Jiří Strohalm Michal Pechar Vladimír Šubr Martin Hrubý Martin Studenovský Mikrobiologický ústav AVČR, v.v.i. Blanka Říhová Marek Kovář Ondřej Hovorka Milada Šírová David Větvička Jakub Tomala Martina Kabešová Pavlina Jungrová Helena Mišurcová 10 03