Translace (druhý krok genové exprese: Od RNA k proteinu) Prezentace Translace se zabývá překladem genetické informace zapsané v mRNA do proteinové sekvence. Milada Teplá, Helena Klímová KUDCH, PřF UK v Praze 2013

Genetický kód a kodon Z funkční mRNA je informace použita pro syntézu proteinu. Genetický kód: pravidla, kterými se řídí přenos z DNA do aminokyselinové sekvence (prostřednictvím mRNA). V genetickém kódu platí konvence, že 5'-konec mRNA je zapisován vlevo! Sekvence nukleotidů mRNA je čtena po trojicích – po kodonech. Na snímku je vytvořená animace, která znázorňuje rozdělení mRNA na kodony. A U G C A G C G A C U G G U A U G C mRNA kodon 3' 5'

Genetický kód Dohromady lze vytvořit 64 (43) kombinací trojic nukleotidů: některé aminokyselině přísluší i několik tripletů (např. CCU, CCA, CCG, CCC je pro prolin) jednomu tripletu přísluší nanejvýš jedna aminokyselina. Genetický kód je téměř univerzální pro všechny organismy. A U G C A G C G A C U G G U A U G C mRNA kodon 3' 5'

Genetický kód V principu může být mRNA překládána ve všech třech čtecích rámcích podle toho, u kterého nukleotidu translace začne. Avšak jen v jednom čtecím rámci vzniká požadovaný protein. Ala Lys Thr Val Stop kodon Val A U G C mRNA A 3' 5' Gln Arg Pro Leu Na snímku je vytvořená animace, která ukazuje možnost vzniknu tří různých sekvencí aminokyselin (tří různých peptidových řetězců) podle toho, od kterého nukleotidu bychom začali překládat. Ser A U G C C mRNA Ser Gly 3' 5' Cys Leu Gln A U G C A mRNA 3' 5'

Genetický kód – všech 64 možných kombinací   Druhý nukleotid U C A G První nukleotid UUU fenyalanin UCU serin UAU tyrosin UGU cystein Třetí nukleotid UUC fenyalanin UCC serin UAC tyrosin UGC cystein UUA leucin UCA serin UAA stop kodon UGA stop kodon (selenocystein) UGG tryptofan UUG leucin UCG serin UAG stop kodon CUU leucin CCU prolin CAU histidin CGU arginin CUC leucin CCC prolin CAC histidin CGC arginin CUA leucin CCA prolin CAA glutamin CGA arginin CUG leucin CCG prolin CAG glutamin CGG arginin AUU isoleucin ACU threonin AAU asparagin AGU serin AUC isoleucin ACC threonin AAC asparagin AGC serin AUA isoleucin ACA threonin AAA lysin AGA arginin AUG methionin ACG threonin AAG lysin AGG arginin GUU valin GCU alanin GAU kyselina asparagová GGU glycin GUC valin GCC alanin GAC kyselina asparagová GGC glycin GUA valin GCA alanin GAA kyselina glutamová GGA glycin GUG valin GCG alanin GAG kyselina glutamová GGG glycin Terminační kodony Terminační kodony Terminační kodony Kodony UAA, UAG a UGA se nazývají terminační někdy též stop kodony. Terminační kodony signalizují konec kódující sekvence. Kodon UGA je bifunkční, má funkci terminace translace a také kóduje aminokyselinu selenocystein, který má svou vlastní tRNA. mRNA pro selenocystein má zvláštní sekundární strukturu, která umožňuje rozpoznat okolí kodonu UGA a zajistit, aby selenocystein byl při translaci inkorporován do bílkoviny. Kodon AUG je bifunkční, slouží jako tzv. iniciační kodon (signalizuje začátek translace) a také jako kodon, ke kterému je přiřazen methionin. U bakterií obvykle správnému nalezení start kodonu pomáhá tzv. Shine-Dalgarnova sekvence (5'-AGGAGGU-3'), která předchází onen správný AUG kodon. Iniciační kodon

tRNA Kodony v mRNA nerozpoznávají přímo aminokyseliny, které specifikují. Translace mRNA do proteinu závisí na tRNA, která se spáruje s kodonem v mRNA. Na tRNA je navázána aminokyselina (aminoacyl-tRNA). Touto částí váže příslušné aminokyseliny Touto částí se páruje s kodonem v mRNA

Aminoacyl-tRNA Na 3'-konec (vždy končí sekvencí CCA) je navázána aminokyselina Antikodon jsou tři nukleotidy komplementární ke kodonu v mRNA

Struktura aminoacyl-tRNA Struktura jetelového listu přibližně 80 nukleotidů dlouhé Skutečný L-tvar tRNA Tento snímek je možné při výuce středoškolské biochemie vynechat či zařadit do semináře. Struktura jetelového listu

Aminoacyl-tRNA-synthetasa - enzym, rozpozná a připojí správnou aminokyselinu k tRNA Kodon pro tryptofan je UGG – antikodon je ACC A C Aminokyselina (Tryptofan) tRNA Snímky č. 10 – 12 týkající se aminoacyl-tRNA-synthetasy je možné při výuce středoškolské biochemie vynechat či zařadit do semináře. Specifické nukleotidy v obou ramenech, antikodonovém i vázajícím aminokyselinu, umožňují rozpoznání každé tRNA vlastní aminoacyl-tRNA-synthetasou. Aminoacyl-tRNA-synthetasa

Aminoacyl-tRNA-synthetasa Reakce katalyzovaná aminoacyl-tRNA-synthetasou vyžaduje dodání energie hydrolýzou ATP. Aminokyselina (Tryptofan) A C ATP AMP + 2Pi Vazba aminokyseliny k tRNA tRNA A C Snímky č. 10 – 12 týkající se aminoacyl-tRNA-synthetasy je možné při výuce středoškolské biochemie vynechat či zařadit do semináře. Aminoacyl-tRNA-synthetasa

Aminoacyl-tRNA-synthetasa Při této reakci vzniká vysokoenergetická vazba mezi tRNA a AMK. Energie je využita pro tvorbu kovalentní vazby mezi rostoucím polypeptidovým řetězcem a nově navázanou aminokyselinou. A C Aminoacyl-tRNA-synthetasa ATP AMP + 2Pi Vazba aminokyseliny k tRNA Makroergická vazba Aminokyselina (Tryptofan) U G Vazba kodonu k antikodonu Párování bází mRNA 5' 3' tRNA Snímky č. 10 – 12 týkající se aminoacyl-tRNA-synthetasy je možné při výuce středoškolské biochemie vynechat či zařadit do semináře.

Translace probíhá na ribosomech E-místo P-místo A-místo Velká ribosomální jednotka P A E Vazebné místo pro mRNA Malá ribosomální jednotka Malá podjednotka zodpovídá za nasednutí tRNA na kodon mRNA. Velká podjednotka katalyzuje vznik peptidové vazby mezi aminokyselinou a polypeptidovým řetězcem. Ribosom se pohybuje podél mRNA, překládá sekvenci mRNA do aminokyselinové sekvence za použití tRNA.

Iniciace translace Začátek na iniciačním kodonu AUG Met Začátek na iniciačním kodonu AUG Pro iniciaci je třeba iniciační tRNA, s navázaným methioninem (u bakterií formyl-methionin). iniciační tRNA s Met U eukaryot: iniciační tRNA je připojená k malé ribosomální jednotce. Malá ribosomální podjednotka Na mRNA je červeně znázorněný iniciační kodon AUG. Na čtyřech snímcích řazených za sebou je stručně popsána a zanimována část průběhu iniciace translace. Pomocí pohyblivých tvarů je docíleno konkrétnosti a pochopení návaznosti. Malá ribosomální podjednotka se i s navázanou iniciační tRNA naváže na 5'-konec mRNA. Po rozpoznání iniciačního kodonu se připojí velká podjednotka. mRNA 5' 3' AUG

Iniciace translace malá podjednotka se váže na 5'-konec mRNA pohybuje se ve směru 5' → 3' a hledá kodon AUG, který je rozpoznán antikodonem iniciační tRNA. Met mRNA 5' 3' AUG

Iniciace translace malá podjednotka se váže na 5'-konec mRNA pohybuje se ve směru 5' → 3' a hledá kodon AUG, který je rozpoznán antikodonem iniciační tRNA. E P A Po rozpoznání iniciačního kodonu se připojí velká ribosomální podjednotka. Velká ribosomální podjednotka Iniciační tRNA se váže do P-místa, prodlužování řetězce může ihned začít navázáním druhé tRNA s aminokyselinou do A-místa. Met E P A Met mRNA 5' 3' AUG AUG AUG

Iniciace translace aa2 malá podjednotka se váže na 5'-konec mRNA pohybuje se ve směru 5' → 3' a hledá kodon AUG, který je rozpoznán antikodonem iniciační tRNA. Po rozpoznání iniciačního kodonu se připojí velká ribosomální podjednotka. Iniciační tRNA se váže do P-místa, prodlužování řetězce může ihned začít navázáním druhé tRNA s aminokyselinou do A-místa. E P A Met AUG mRNA 5' 3'

Iniciace translace V dalším kroku dochází ke vzniku peptidové vazby mezi methioninem a přicházející aminokyselinou (aa2). Met aa2 E P A 5' 3' AUG mRNA

Iniciace translace V dalším kroku dochází ke vzniku peptidové vazby mezi methioninem a přicházející aminokyselinou (aa2). Ribosom se posune o 3 nukleotidy podél mRNA. tRNA bez navázané aminokyseliny se uvolní z E-místa a tRNA z A-místa se přenese do P-místa. Met aa2 E P A 5' 3' AUG mRNA

Elongace translace Neustále opakován tříkrokový cyklus: První krok: aminoacyl-tRNA je navázána do A-místa. aa4 Na třech snímcích řazených za sebou je zanimován pomocí pohyblivých objektů průběh elongace translace, během které dochází k prodlužování peptidového řetězce. NH2 aa1 aa2 aa3 E P A 5' 3' mRNA

Elongace translace Neustále opakován tříkrokový cyklus: První krok: aminoacyl-tRNA je navázána do A-místa. Druhý krok: vznik peptidové vazby. aa3 aa2 aa1 NH2 aa4 E P A 5' 3' mRNA

Elongace translace Neustále opakován tříkrokový cyklus: První krok Druhý krok Třetí krok - aminoacyl-tRNA je navázána do A-místa. - vznik peptidové vazby. - ribosom se posune o 3 nukleotidy. - tRNA bez navázané AMK se uvolní z E-místa. - tRNA z A-místa se přenese do P-místa. aa3 aa2 aa1 NH2 aa4 E P A 5' 3' mRNA

Elongace translace První krok - aminoacyl-tRNA je navázána do A-místa. Druhý krok - vznik peptidové vazby. Třetí krok - ribosom se posune o 3 nukleotidy. - tRNA bez navázané AMK se uvolní z E-místa. - tRNA z A-místa se přenese do P-místa. aa5 aa3 aa2 aa1 NH2 aa4 aa5 E P A 5' 3' mRNA

Elongace translace mRNA je překládána ve směru 5' → 3' aa4 aa3 aa2 aa1 NH2 aa5 tRNA Rostoucí peptidový řetězec Posun o tři nukleotidy Elongace translace mRNA je překládána ve směru 5' → 3' nejprve vzniká N-konec proteinu (polypeptidový řetězec roste směrem od N-konce k C-konci). Celý cyklus všech tří kroků je opakován dokud ribosom nenarazí na stop-kodon.

Terminace translace Konec proteinu je signalizován přítomností stop kodonu (UAA, UAG nebo UGA). do A-místa se váže uvolňovací faktor místo AMK se váže molekula vody uvolní se C-konec polypeptidového řetězce z tRNA v P-místě Uvolňovací faktor NH2 Na třech snímcích řazených za sebou je pomocí pohyblivých objektů zanimován průběh terminace translace. K tomuto procesu dochází, jakmile se na mRNA objeví terminační kodon (na obrázku je červeně znázorněný terminační kodon UAA). aa1 aa3 aa2 E P A aa4 aa5 5' 3' UAA mRNA

Protein se uvolňuje do cytoplasmy. Terminace translace Konec proteinu je signalizován přítomností stop kodonu (UAA, UAG nebo UGA). do A-místa se váže uvolňovací faktor místo AMK se váže molekula vody uvolní se C-konec polypeptidového řetězce z tRNA v P-místě H2O NH2 aa5 aa4 aa3 aa2 aa1 COOH NH2 aa5 aa4 aa3 aa2 aa1 Protein se uvolňuje do cytoplasmy. E P A 5' 3' mRNA UAA

Terminace translace mRNA se odpojí od ribosomu dojde k disociaci obou podjednotek ribosomu E P A 5' 3' UAA mRNA

Použitá literatura ALBERTS, B. a kol. Základy buněčné biologie. Ústí nad Labem: Espero Publishing, 1997. NEČAS, O. a kol. Obecná biologie pro lékařské fakulty. Jinočany: Nakladateství H&H, 2000. KUBIŠTA, V. Buněčné základy životních dějů. Praha: Scientia, 1998. Obrázky: Milada Teplá (v MS powerpoint, Adobe flash)