Biochemie – základní genetické pochody

Prezentace na téma: "Biochemie – základní genetické pochody"— Transkript prezentace:

1 Biochemie – základní genetické pochody
Josef Trögl

2 Genetická informace Pořadí bází určuje genetickou informaci
Gen = úsek NK kódující nějakou funkci Strukturní gen – kóduje strukturu bílkoviny Gen pro RNA – kóduje strukturu RNA Soubor všech genů = genom Kromě genů jsou v NK i další úseky Regulační (řídící) Nekódující – bez funkce nebo s neznámou funkcí – evolučně pokročilejší organismy mají více nekódujících sekvencí

3 Genetické pojmy Intron = sekvence DNA nekódující bílkovinu vmezeřená do strukturního genu Sestřih = proces odstraňování intronů ze strukturního genu Promotor = sekvence DNA uvozující gen nebo operon Operon = sekvence několika genů se společnou regulací Kodon = trojice bází kódující jednu aminokyselinu v peptidovém řetězci Antikodon = sekvence tří bazí komplementární ke kodonu

4 Typy RNA mRNA (messanger, mediátorová) = přenos exprimovaných genů z jádra na ribozómy rRNA (ribozomální) = stavební funkce v ribozómech, uplatňují se při translaci tRNA (transferová) = čtení genetického kódu, přenos aminokyselin při syntéze proteinů

5 Základní genetické pochody
Replikace (zdvojení) = kopírování genetické informace do nové molekuly NK Transkripce (přepis) = kopírování malé části genetické informace z DNA do RNA Translace (překlad) = syntéza primární struktury bílkoviny podle informace v RNA

6 Základní genetické pochody
DNA replikace transkripce reverzní transkripce replikace RNA translace „Základní dogma molekulární biologie“ Bílkovina

7 Replikace Nutná pro předání genetické informace další generaci
Enzym DNA polymeráza Rozpletení dsDNA Ke každému vláknu je dosyntetizováno druhé komplementární Semikonzervativní (polovina nové molekuly DNA pochází od rodiče, polovina je nová)

8 Semikonzervativní replikace

9 P G C T A P P P A A T G A T T C P P P P P G C T A

10 Funkční protein Exprese genů transkripce translace gen mRNA polypeptid
Soubor pochodů vedoucích od genu po funkční bílkovinu Možná regulace na všech úrovních transkripce translace gen mRNA polypeptid posttranslační modifikace transport Funkční protein

11 Transkripce Přepis jednoho nebo několika genů z DNA do mRNA
Enzym RNA polymeráza

12 Reverzní transkripce Pouze u tzv. retrovirů (např. HIV)
Přepis z RNA do DNA Enzym reverzní transkriptáza – nekontroluje chyby  mutace Vzniklá DNA je integrována (začleněna) do genomu  může vzniknout rakovina

13 Translace mRNA Syntéza bílkovin podle genetické informace
Probíhá na ribozómech Ribozóm se posouvá po mRNA a syntetizuje peptid Čtení genetické informace podle genetického kódu mRNA

14 Genetický kód Soubor kódů pro všechny aminokyseliny
20 kódovaných aminokyselin Jedna aminokyselina je kódována třemi bázemi (tzv. triplet nebo kodon) Triplet = 64 kombinací  genetický kód je degenerovaný (více kódů pro jednu aminokyselinu) Genetický kód je univerzální (= až na výjimky stejný ve všech organismech)

15 Genetický kód

16 Čtení genetického kódu
5’- A U U C G G C U U A G G - 3’ N Ile Arg Leu Arg C Nukleové kyseliny jsou čteny i syntetizovány od 5’ konce Bílkoviny jsou čteny i syntetizovány od N konce

17 Čtecí rámec 1 aminokyselina je kódována 3 bázemi = záleží na tom, kde se začne číst Čtecí rámec, jsou 3 možné začátky čtení, ale jen jeden je správný 5’- A U U C G G C U U A G G - 3’ N Ile Arg Leu Arg C

18 Čtecí rámec 5’- A U U C G G C U U A G G - 3’ N Ile Arg Leu Arg C

19 Čtecí rámec 5’- A U U C G G C U U A G G - 3’ N Ile Arg Leu Arg -C N Phe Gly Leu C

20 Čtecí rámec 5’- A U U C G G C U U A G G - 3’ N Ile Arg Leu Arg C N Phe Gly Leu C N Ser Ala STOP C

21 Genomika Genetická informace uložena v DNA U některých virů i v RNA
Genomika = věda zabývající se genomy a genetickou informací Velikost genetické informace se udává v párech bazí (base pairs = bp)

22 Velikost genomů Organismus Bp Bakterioág MS2 3569 Escherichia coli 4.106 Mycoplasma genitalium Nanoarchaeum equitans Saccharomyces cerevisiae 2.107 Populus trichocarpa (topol) 4,8.108 Homo sapiens sapiens (člověk) 3,2.109 Fritillaria assyriaca 1,3.1011 Amoeba dubia (měňavka) 6,7.1011

23 Genetická informace Jaderná Mimojaderná
Chromózómy = hlavní „velké“ DNA Mimojaderná Plasmidy = malé kruhové DNA u bakterií DNA v organelách (mitochondrie, plastidy)

24 Bakteriální genóm Obvykle kruhová DNA Obvykle jeden chromozóm
Volně v cytoplazmě DNA obalena alkalickými aminy (spermin a spermidin) Časté plasmidy, i několik desítek Bez intronů Geny uspořádány do operonů

25 Eukaryotický genom Lineární DNA Obvykle více chromozómů (člověk 46)
DNA je uložena v jádře obaleném dvojitou membránou Zahuštěna do kompaktní struktury pomocí alkalických bílkovin (histonů) Plasmidy výjimečné Geny mají introny Operony nenacházíme

26 Archeální genóm Mezistupeň mezi bakteriemi a eukaryoty
Obvykle lineární Volně v cytoplasmě DNA obalena bílkovinami podobnými eukaryotickým histonům Primitivní introny Plasmidy (méně než bakterie) Geny organizované do operonů

27 Plasmidy Krátké cyklické úseky DNA Výskyt zejména u bakterií
V buňce může být i několik stovek plasmidů, stejných i různých Některé plasmidy vzájemně nekompatibilní (nemohou být v jedné buňce) Nezávisle se replikují Občas vymizení

28 Plasmidy Postaru nazývané faktory
Kódují vlastnosti, které bakterie k životu nutně nepotřebuje rezistenci vůči antibiotikům (tzv. RTF – Resistence Transfer Factor) nové metabolické dráhy (např. odbourávání uhlovodíků apod.) produkce toxinů

29 Plasmidy Význam v genetickém inženýrství
umělé plasmidy s požadovanými vlastnostmi

30 Replikace u bakterií Dvojsměrná 3 fáze Iniciace (zahájení)
v tzv. místě ori (origin = počátek) Elongace (prodlužování) Terminace (zakončení)

31 Replikační enzymy u bakterií
DNA polymerázy multienzymové komplexy 3 druhy (DNA-pol I. II. a III.) dNTP + DNAn  PP + DNAn+1 dNTP = dATP, dGTP, dCTP, dTTP napojování nukleotidů na 3’-konec neumí začátek řetězce, jen napojovat, potřebuje tzv. primer (očko) = krátká sekvence DNA nebo RNA DNA primáza syntetizuje krátký fragment RNA - primer

32 dTTP dCTP N H 2 O P - dATP dGTP

33 Replikační enzymy u bakterií
DNA ligáza spojuje delší řetězce DNA DNA helikázy rozplétají dvojšroubovici na jednotlivá vlákna

34 Iniciace replikace 1. Rozpoznání ori místa 2. Navázání helikáz
DnaA proteiny – najdou ori místo a oddělí v něm oba řetězce DNA ori místo je bohaté na AT páry = jen 2 H-můstky = snadno se oddělí vznik tzv. replikační vidlice 2. Navázání helikáz na oba konce vidlice se naváže helikáza a začne rozplétat DNA 3. Navázání DNA polymeráz a dalších replikačních enzymů

35 Iniciace replikace A A A A

36 Iniciace replikace A A A A

37 Iniciace replikace A A A A H H

38 Iniciace replikace A H H A A A

39 Iniciace replikace A H H A A A

40 Iniciace replikace Pol A H Pol H A A A

41 Iniciace replikace Pol A H Pol H A A A

42 Elongace DNA Syntézu obou řetězců katalyzuje enzymový komplex DNA-polymerázy III. Semidiskontinuální = jeden řetězec se syntetizuje nepřetržitě (vedoucí řetězec = leading strain) a jeden po kratších úsecích (opožďující se řetězec = lagging strain) Okazakiho fragmenty = krátké úseky DNA ( nukleotidů) DNA polymeráza syntetizuje řetězec ve směru 5’-3’, ale řetězce mají opačnou orientaci cca 500 nukletidů / s kontrola chyb

43 Semidiskontinuální elongace
3’ 5’ vedoucí řetězec Pol 5’ 3’ Okazakiho fragmenty opožďující se řetězec 3’ 5’

44 Elongace DNA Syntéza opožďujícího se řetězce:
Syntéza RNA primeru (primáza) Elongace fragmentu (DNA polymeráza I.) Odstranění primeru (DNA polymeráza I.) Zaplnění mezery (DNA polymeráza I.) Spojení řetězců (DNA ligáza)

45 Semidiskontinuální elongace
3’ 5’ vedoucí řetězec Pol 5’ 3’ primery opožďující se řetězec 3’ 5’

46 Terminace replikace Na tzv. ter místě Tus protein – inhibice helikázy

47 Replikace plasmidů Analogická repliklaci chromozómů
Časově oddělená replikace vedoucího a opožďující se řetězce – tzv. replikace valivou kružnicí nejprve je syntetizován vedoucí řetězec, který vytlačí původní – 1. kopie plasmidu k vytlačenému původnímu řetězci se pomocí Okazakiho fragmentů dosyntetizuje nový řetězec – 2. kopie plasmidu

48 Replikace plasmidů

49 Replikace u eukaryot V principu stejná jako u bakterií Odlišnosti
jiné DNA polymerázy (ale s podobnou funkcí) replikace probíhá na mnoha místech naráz eukaryotické chromozómy jsou lineární  na 5’ konci nových řetězců chybí úsek, který není na co navázat – speciální enzym telomeráza 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’

50 Replikace u archeí Velice podobná bakteriální replikaci
DNA polymerázy strukturně podobné eukaryotickým, ale s podobnou funkcí jako u bakterií

51 Transkripce u bakterií
3 fáze Iniciace (zahájení) Elongace (prodlužování) Terminace (zakončení) Enzym RNA-polymeráza 5 podjednotek – a2bb’s Transkripce je zahajována na promotoru – uvozující úsek DNA různé promotory u různých genů Rychlost cca 40 nukleotidů / s řádově pomalejší než replikace

52 Sigma faktor Podjednotka s (sigma faktor) má za úkol rozpoznat promotor bakterie mají více sigma faktorů pro geny různého typu Síla promotoru = pravděpodobnost zahájení transkripce geny se silnějším promotorem jsou více exprimovány závisí na sekvenci promotoru i sigma faktoru

53 Pozitivní a negativní řetězec
Transkripcí dsDNA vzniká ssRNA Přepisuje se jen jedno vlákno ze dvou = negativní vlákno Nepřepisované vlákno = pozitivní vlákno Analogie s fotografií – negativ a pozitiv

54 Iniciace transkripce s a2bb’
1. Spojení sigma-faktoru s RNA polymerázou s a2bb’ - řetězec +řetězec promotor přepisované geny

55 Iniciace transkripce a2bb’ s
2. Sigma podjednotka rozpozná promotor a naváže RNA polymerázu na DNA s a2bb’ - řetězec +řetězec promotor přepisované geny

56 Iniciace transkripce 3. Rozpletení DNA - řetězec +řetězec

57 Iniciace transkripce 4. Zahájení syntézy RNA - řetězec +řetězec

58 Elongace RNA 5. Syntéza RNA – sigma-faktor se oddělí - řetězec

59 Terminace transkripce
Pomocí vlásenky terminátor = koncový úsek přepisované RNA palindromatická sekvence (symetrická) = páruje se sama se sebou a vzniká vlásenka vlásenka „vykolejí“ RNA polymerázu Pomocí r-faktoru bílkovina, rozpoznávající terminátor interakce s RNA polymerázou a ukončení transkripce

60 Transkripce u eukaryot
V principu stejná jako u bakterií Odlišnosti více RNA polymeráz odlišných od bakteriální odlišné promotory k zahájení transkripce jsou potřeba iniciační faktory (bílkoviny); obvykle několik složitější iniciace složitější terminace, nejčastěji pomocí tzv. polyadenylačního signálu = sekvence AATAAA Posttranskripční úpravy mRNA

61 Posttranskripční úpravy mRNA
U eukaryot je přepsaná mRNA ještě podrobena tzv. posttranskripčním úpravám vytvoření tzv. čepičky na 5’-konci komplex se specifickými proteiny sestřih = odstranění intronů polyadenylace 3’-konce

62 Transkripce u archeí Podobnosti i odlišnosti proti bakteriím a eukaryím Podobnosti s eukaryotickou transkripcí podobné RNA-polymerázy podobné iniciační faktory Podobnosti s bakteriální transkripcí žádné posttranskripční úpravy mRNA podobné promotory přepis operonů do jedné mRNA

63 Bakteriální translace

64 tRNA Prostředník při překladu z genetického kódu do „řeči“ aminokyselin Jednu aminokyselinu může přenášet více tRNA = izoakceptorové Ve struktuře tRNA jsou zařazeny i nestandardní nukleotidy (pseudouridin, 1-methylguanozin…) – vznik modifikací standardních nukleotidů 74-95 nukleotidů sekundární struktura připomíná jetelový lístek

65 tRNA Vazebné místo pro aminokyselinu Smyčky Antikodon

66 Antikodon Sekvence 3 nukleotidů komplementární s kodonem pro danou aminokyselinu Nestandardní nukleotidy umožňují rozšířené párování

67 Aktivace aminokyselin
Proces napojování aminokyselin na tRNA Pro každý pár aminokyselina-tRNA existuje jeden enzym aminoacyl-tRNA-syntetáza Rozpoznává správné aminokyseliny i tRNA Syntetizuje jejich vazbu (energie ze štěpení ATP) aa + ATP  aa-AMP + PP aa-AMP + tRNA  aa-tRNA + AMP

68 Aktivace aminokyselin
Proces napojování aminokyselin na tRNA Pro každý pár aminokyselina-tRNA existuje jeden enzym aminoacyl-tRNA-syntetáza Rozpoznává správné aminokyseliny i tRNA Syntetizuje jejich vazbu (energie ze štěpení ATP) aa + ATP  aa-AMP + PP aa-AMP + tRNA  aa-tRNA + AMP

69 Bakteriální ribozómy Kuličky složné z bílkovin a rRNA
Označení komponent podle sedimentačního koeficientu celý bakteriální ribozóm má sedimentační koeficient 70S 16S-rRNA, 23S-rRNA, 5S-rRNA Dvě podjednotky malá 30S velká 50S

70 Vazebná místa na ribozómu
Vazebné místo pro mRNA Aminoacylové místo (A-místo) – vazba nepřipojené aa-tRNA Peptidylové místo (P-místo) – vazba už hotového peptidového řetězce Výstupní místo pro tRNA (E-místo) – odchod deacylované tRNA

71 Průběh translace Iniciace Elongace – prodlužování řetězce Terminace
rozpoznání čtecího rámce zařazení první aminokyseliny (formylmethionin) iniciační faktory (IF) - bílkoviny Elongace – prodlužování řetězce elongační faktory (EF) Terminace terminační (nesmyslný) kodon = nekóduje žádnou aminokyselinu, ale konec řetězce účast terminačních faktorů (RF)

72 Iniciace translace 1.Rozpad ribozómu na podjednotky E P A

73 Iniciace translace 2.Navázání fMet-tRNA fMet E P A

74 Iniciace translace 3.Navázání mRNA
správné umístění pomocí tzv. Shine-Dalgarnovy sekvence E P A fMet

75 Shine-Dalgarnova sekvence
Sekvence AGGA na mRNA, která se páruje s UCCU na 16S-rRNA Zajišťuje správné umístění mRNA na ribozóm ribozóm 3’ 5’ 16S-rRNA UCCU AGGA AUG iniciační kodon 5’ 3’ mRNA

76 Iniciace translace 4.Znovuspojení ribozomálních podjednotek E P A fMet

77 Elongace polypeptidového řetězce
6. Navázání další aminokyseliny do A místa Trp E P A fMet

78 Elongace polypeptidového řetězce
7. Vznik peptidové vazby fMet E P A Trp

79 Elongace polypeptidového řetězce
8. Posun ribozómu E A fMet P Trp

80 Elongace polypeptidového řetězce
9. Navázání další aminokyseliny E A fMet P Trp Lys

81 Elongace polypeptidového řetězce
10. Vznik peptidové vaby fMet Trp E A P Lys

82 Elongace polypeptidového řetězce
11. Posun ribozómu fMet Trp E A P Lys

83 Elongace peptidového řetězce
mRNA

84 Terminace translace Terminační faktory RF1 a RF2 rozpoznají terminační kodón a za spolupráce s RF3 způsobí uvolnění tRNA, peptidu a rozpad ribozómu na podjednotky

85 Rychlost proteosyntézy
10-20 aminokyselin / s chybovost cca 1 nesprávná aminokyselina na 2000 správných

86 Translace polygenních RNA
U bakteriích je mnoho mRNA polygenních = nesou více genů (např. operony) U každého genu nová iniciace translace

87 Návaznost transkripce a translace
U bakterií dochází k rychlému navazování transkripce a translace na nehotovou mRNA už nasedají ribozómy a překládají polypeptid na jedné RNA může být současně ribozómů posunujících se „za sebou“

88 RNA pol DNA RNA

89 peptid ribozóm ribozóm ribozóm ribozóm ribozóm ribozóm RNA pol DNA RNA

90 Eukaryotická transalce
V principu podobná bakteriální ale s odlišnostmi ribozómy jsou větší a odlišné (80S) volné vázané na endoplasmatické retikulum – syntéza membránových bílkovin první aminokyselinou je methionin a ne formylmethionin eukarya nepoužívají Shine-Dalgarnovu sekvenci, správný začátek transalce je rozpoznáván pomocí čepičky více translačních faktorů

91 Eukaryotická transalce
Prostorové oddělení eukaryální transkripce a translace transkripce probíhá v jádře translace probíhá mimo jádro – nutný transport Časové oddělení translace probíhá teprve po dokončení všech posttranskripčních úprav

92 Archeální transalce Podobnosti s bakteriální transalcí
podobné ribozómy používání Shine-Dalgarnovy sekvence Podobnosti s eukaryální translací podobné translační faktory