Vybrané metody analytické chemie ELEKTROFORÉZA

Princip elektroforetických separací Jsou založeny na migraci nabitých částic v elektrickém poli Kulová částice o poloměru r náboji z je hnána gradientem elektrického pole mezi dvěma elektrodami směrem k elektrodě opačného znaménka a bržděna třením Hnací síla je úměrná intenzitě elektrického pole E a celkovému náboji částice Q FE=QE Třecí síla je podle Stokesova zákona přímo úměrná poloměru a rychlosti částice FF=-6πηrν

Princip elektroforetických separací V ustáleném stavu se obě síly vyrovnávají QE = 6πηrν (E=U/Lc) (V/m) a z toho vyplývá, že νef = E . (Q/ 6πηr) (m/s) Q/ 6πηr = μef (m2/Vs) μef - efektivní elektroforetická pohyblivost (získaná z experimentu), u kationtů kladné, u aniontů záporné Nabité částice migrují v elektrickém poli tím rychleji, čím jsou menší a čím větší nesou náboj

Princip elektroforetických separací Ionty v roztoku jsou solvatovány (ve vodě hydratovány) – teorie elektrolytů Solvatační obal je složitý a závisí Na složení systému Na experimentálních podmínkách Ionty nejsou nezávislé, ale vzájemně se ovlivňují Nevýhoda - predikce elektroforetického chování v daném systému pouze přibližná – do jisté míry empirická Výhoda - možnost široce modifikovat průběh separací volbou složení separačního systému a experimentálních podmínek

Princip elektroforetických separací Při práci s velmi zředěnými roztoky platí Kohlrauschův zákon o neodvislé vodivosti (pohyblivosti) iontů, který je definován pro nekonečné zředění Λ0=Σλ0i Λ0-celková molární vodivost roztoku λ0-molární vodivosti iontů při ∞ zředění  v analytických elektroforetických separacích se migrující separované ionty vzájemně neovlivňují Pohyblivost jednotlivých iontů regulujeme manipulací hodnot Q a r Náboj iontů slabých elektrolytů měníme změnou stupně disocace (pH), u silných i slabých elektrolytů koordinačními reakcemi s vhodnými ligandy – tvorba komplexů

Princip elektroforetických separací Elektroosmotický tok - elektroosmóza Na každém rozhraní fází které obsahuje nabité částice vznikne na základě elektrostatických zákonů elektrická dvojvrstva – kompaktní Helmholtzova vrstva a difúzní vrstva Tato vrstva má vlastnosti deskového kondenzátoru – potenciálový rozdíl mezi vnitřní a vnější hranicí difúzní vrstvy se nazývá elektrokinetický potenciál – zeta (ξ) potenciál

Princip elektroforetických separací Elektroosmóza Křemenné kapiláry obsahují na povrchu siloxanové a silanolové skupiny, které za přítomnosti elektrolytu hydrolyzují a podle pH disociují – povrch nese záporný náboj Vytváří se Helmholtzova a difuzní vrstva Vloží li se napětí, začnou se solvatované ionty v difúzní vrstvě pohybovat k opačné elektrodě včetně solvátových obalů a jejich prostřednictvím dochází k pohybu celého objemu roztoku

Princip elektroforetických separací V závislosti na pH (velikosti povrchového náboje) nastane v kapiláře mechanický pohyb roztoku – elektroosmotický tok, jehož rychlost je úměrná zeta-potenciálu (ξ), intenzitě pole (E), relativní permitivitě roztoku (ε) a nepřímo úměrný viskozitě (η) νEOF = E.ε ξ/η = E.μEOF μEOF – elektroosmotická pohyblivost

Princip elektroforetických separací Rychlost EOF se přičítá k migrační rychlosti částic pokud migrují stejným směrem a odečítá od rychlosti částic, které migrují opačným směrem Vlivem EOF se kapilárou pohybují kationty, anionty, ale i neutrální molekuly EOF - další významný parametr, kterým lze ovlivnit separaci – lze měnit rychlost i směr EOF, případně ho vyloučit (neutrální povrch) Změnou složení roztoku (pH) Modifikací povrchu kapiláry

Kapilární elektroforéza x chromatografie Elektroforeogramy formálně podobné chromatogramům Základní rozdíl je hnací síla, která způsobí pohyb solutů v systému Chromatografie – mechanický přetlak Elektroforéza – elektrostatické síly které vedou k Migraci solutů Elektroosmotickému toku Liší se profily průtoků Chromatografie parabolický Elektroosmotický je plochý - menší rozmytí zón- účinnější

Elektroforetické techniky Volná elektroforéza proteinů v trubici (Tiselius)- migraci v elektrickém poli ruší pohyb částic způsobený teplotní konvekcí a difúzí Elektroforéza na papíře (málo používaná) nebo na tenké vrstvě gelu – rutinní technika pro separaci velkých molekul (DNA) Kapilární zónová elektroforéza (CZE) Kapilární gelová elektroforéza (CGE) Afinitní kapilární elektroforéza (ACE ) Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MEKC) Elektrochromatografie v naplněných kapilárách (CEC) Kapilární izoelektrické fokuzování Kapilární izotachoforéza

Kapilární zónová elektroforéza (CZE) Vhodná pro separaci iontů lišících se svou molekulovou hmotností, tvarem a nábojem Nabité molekuly dělí na základě rozdílných elektroforetických pohyblivostí (mobilit) Elektroosmotický tok tlumivého roztoku unáší nabité ionty k detektoru a tyto ionty migrují uvnitř tlumivého roztoku různými elektroforetickými rychlostmi a tím se vzájemně dělí Běhe jednoho experimentu lze tedy dělit, detegovat a stanovit jak kationty, tak i anionty CZE lze použít pouze pro molekuly s nábojem. Nenabité molekuly a částice se pohybují elektroosmotickým tokem a vzájemně se nedělí

Kapilární zónová elektroforéza (CZE) Separace se provádí v kapiláře z taveného křemene s vnitřním průměrem 25-100μm, vnějším nejčastěji 375 μm pokryté vrstvou polyimidu Využívá se elektroforetické migrace a osmotického toku kapaliny kapilárou na kterou je vloženo vysoké napětí (desítky kV) V zásaditých pufrech je EOF srovnatelný s lineární rychlostí mobilní fáze v HPLC, v kyselých je výrazně nižší EOF závisí i na koncentraci pufru – vyšší koncentrace generují pomalejší EOF a naopak. Velmi nízké koncentrace pufrů (pod 10mmol/l) nejsou schopny zajistit konstantní pH v systému a vedou k nereprodukovatelným výsledkům

Kapilární zónová elektroforéza (CZE) Rychlostní profil v kapalině hnané elektroosmózou je plochý a proto je dosahováno vyšších účinností než v HPLC Vlivem elektrického proudu (desítky až stovky μA) vzniká Jouleovo teplo, které je nutno odvést stěnou kapiláry do okolí a deformuje rychlostní profil. Čím vodivější pufr a čím větší průměr kapiláry, tím více Jouleova tepla vzniká a to vede ke zhoršení separace – kapiláru ochlazovat kapalinou nebo proudícím vzduchem

Schéma přístroje pro CZE Vstupní, výstupní nádobky a separační kapilára se naplní vhodným elektrolytem (např. tetraboritan sodný o konc. 20 mmol/l, pH=9,1- generuje vysoký EOF, neabsorbuje v UV/VIS) Před vlastní analýzou připojit separační napětí v desítkách kV na elektrody po dobu několika minut, aby se stabilizoval EOF a vnitřní povrch kapiláry. Proud by neměl přesáhnout 100μA- Joulovo teplo

Dávkování v CZE Elektrokinetické dávkování. Hydrodynamické dávkování Vstupní nádobka se vymění za nádobku se vzorkem Na elektrody se připojí dávkovací napětí na několik sekund (např. 5kV na 6s) Během této doby se do kapiláry nasaje malé množství vzorku (jednotky až desítky nl) Nadávkovaný zorek je obohacen o kationty Hydrodynamické dávkování Kapilára se ponoří do vzorku Tlakem plynu se po uzavření vzorkovací nádobky natlačí několik nl do kapiláry Potřebného přetlaku lze dosáhnout i zvednutím nádobky se vzorkem nad výstupní nádobku Složení vzorku se nemění

Zakoncentrování (sample stacking) Při dávkování zředěného vzorku, který má menší vodivost než separační elektrolyt dochází po vložení separačního napětí k zakoncentrování na rozhraní mezi vzorkem a separačním elektrolytem Zóna vzorku o menší vodivosti si vynutí větší intenzitu pole než je v elektrolytu. Kationty uvnitř zóny pak migrují větší rychlostí na přední rozhraní, kde se zpomalí, nakupí a zakoncentrují a do separačního elektrolytu migrují menší rychlostí. Anionty se naopak koncentrují na zadním rozhraní

Analýza CZE Po nadávkování se kapilára opět ponoří do vstupní nádobky s elektrolytem a připojí se separační napětí (desítky kV) Celá nadávkovaná zóna je unášena EOF ke katodě (detektoru) Látky s nábojem navíc migrují elektroforetickými rychlostmi uvnitř elektrolytu a vytváří vlastní zóny Neutrální látky se nedělí a pohybují se v jediné zóně EOF

Detekce v CZE Fotometrický detektor UV/VIS měří absorpci uvnitř kapiláry na jejím konci před výstupní nádobkou. V místě měření je nutno kapiláru zbavit polyimidové vrstvy (okénko několik mm) Přímá absorpční detekce- dělené látky absorbují v UV/VIS oblasti a elektrolyt málo, nebo vůbec Nepřímá detkce – pro ionty, které neabsorbují (anorganické Na+, Ca2+, .. , Cl-, SO42- atd.) přidáme elektrolyt který obsahuje silně absorbující kationt (např. Cu2+) pro detekci kationtů, nebo aniont (CrO42-) pro detekci aniontů. Dostanee negativní pík, neboť v zóně neadsorbující iont vytěsní barevný

Detekce v CZE Detektor s diodovým polem (DAD) Fluorescenční detektor využívající laserem indukovanou fluorescenci – nejcitlivější pro fluoreskující analyty Bezkontaktní vodivostní detektor –měří vodivost uvnitř kapiláry, která se průchodem zón mění – pro neasorbující analyty (cukry, aminokyseliny,..) Elektrochemický detektor (ampérometrický)pro elektrochemicky aktivní analyty Hmotnostní detektor

Elektroferogram CZE Kvalitativní informace – migrační čas příslušné sloučeniny a z něho lze vypočítat elektroforetickou pohyblivost analytu Kvantitativní informace – plocha píku. Vzhledem k často kolísajícímu EOF se místo ploch vyhodnocuje korigovaná plocha píku, což je plocha píku dělená migračním časem analytu Pro kvatifikaci lze využít všechny běžné postupy (metoda vnějšího i vnitřního standardu, vnitřní normalizace, standardního přídavku). Pracujeme s korigovanými plochami píků

Využití CZE Využívá se ke stanovení nejrůznějších anorganických i organických sloučeni iontové povahy Separaci lze výrazně ovlivňovat volbou elektrolytu Volba pH ovlivňuje stupeň disociace látek a tí i jejich efektivní pohyblivosti Přídavkem chirálního selektoru do elektrolytu (cyklodextrin) lze separovat i enantiomery opticky aktivních látek

Kapilární gelová elektroforéza (CGE) Elektroforéza v matrici gelu umožňuje separace vysokomolekulárních biologicky aktivních látek (peptidů, bílkovin, polynukleotidů, ..) na základě velikosti jejich molekul Lze ji realizovat na desce, koloně nebo v separační kapiláře naplněné gelem – kapilární gelová elektroforéza. Analyty, lišící se velikostí a tvarem molekul migrují póry gelu, což zvyšuje rozdíly jejich elektroforetických rychlostí Gel v kapiláře brání vzniku EOF a proto může být separován jen jeden typ iontů (buď kationty, nebo anionty)

Kapilární gelová elektroforéza (CGE) Nejčastěji používaným gelem v CGE je polyakrylamid Chemický gel – radikálovou polymerací akrylamidu a bis-akrylamidu (síťující složka) uvnitř separační kapiláry Vzájemným poměrem obou monomerů lze řídit velikost pórů Obtížná příprava bez bublinek vzduchu a nemožnost výměny náplně Fyzikální gely – vzájemným propletením lineárních řetězců (polyakrilamid, agarosa, methylcelulosa, polyethylenglykol aj.) Výhodou je menší viskozita, možnost výměny gelu před každou analýzou – lepší reprodukovatelnost Nachází uplatnění pro vysokoúčinné separace a určování molekulových hmotností velkých nabitých molekul, hlavně fragmentů DNA a RNA

Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) Metoda vyvinutá pro analýzu neutrálních molekul hydrofobní i hydrofilní povahy Využívá solvatace těchto látek v micelách, které vzniknou v separačním tlumivém roztoku po přidání povrchově aktivní látky (tenzidu) – nejčastěji SDS (dodecylsíran sodný) Ve vodném prostředí se molekuly po překročení kritické micelární koncentrace začnou organizovat do kulovitých útvarů-micel a vytváří micelární fázi, která má polární povrch tvořený sulfátovými skupinami a nepolární dutinu (kavitu)

Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) Hydrofobní dutiny micel SDS jsou schopny do sebe pojmout nepolární molekuly a tím dochází k jejich solvataci a rozpouštění v micelární fázi Ve vodném pufru s micelami tenzidu se budou molekuly analytů podle své polarity dělit mezi vodnou a micelární fázi Disociované síranové skupiny na povrchu micel SDS způsobují záporný povrchový náboj micel a tyto v elektrickém poli migrují k anodě Neutrální analyty se podle své polarity více či méně rozpouštějí v kavitách micel a ty je unášejí k anodě Micelární fáze se chová jako stacionární fáze v HPLC s tím rozdílem, že se pohybuje vlastní elektroforetickou rychlostí – označuje se proto jako pseudostacionární fáze

Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) Všechny micely migrují stejnou rychlostí k anodě Čím více analytu je v micelární fázi, tím rychleji se pohybuje k anodě Separační elektrolyt včetně micel a analytů je však EOF unášen ke katodě (detektoru) Rychlost EOF je vyšší než elektroforetická rychlost micel a proto jsou všechny analyty transportovány k detektoru i přes to, že pseudostacionární fáze se pohybuje opačným směrem

Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) Elektoferogram 10-ti neutrálních látek s různou hydrofobností Metanol je nejpolárnější, je unášen pouze EOF a může sloužit jako značkovač EOF Sudan III je velmi nepolární azobarvivo a je prakticky přítomen jen v micelách – slouží jako značkovač micel Všechny neutrální analyty se mohou nacházet mezi těmito dvěma látkami a vymezují eluční okno

Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) Lze použít i jiné detergenty. Aniontové se chovají jako SDS Katiotové tenzidy se organizují do micel s kladným nábojem na povrchu a putují ke katodě Při přidání kationtového tenzidu do separačního elektrolytu však dojde k převrácení EOF. Tenzid změní náboj na povrchu kapiláry Pseudostacionární fáze tvořená micelami kationtového tenzidu opět proudí proti EOF

Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) Analyty, které mohou protonizovat či disociovat a nést náboj se vedle distribuce mezi vodnou a pseudostacionární fázi v nabité formě pohybují vlastní elektroforetickou rychlostí Migrační čas zóny slabě kyselého či bazického analytu bude dán součtem všech transportních mechanizmů, které se u molekul i iontů uplatňují a analyt vytváří jedinou vlastní specifickou zónu

Kapilární elektrochromatografie (CEC) Kapilární elektrochromatografie (CEC) kombinuje elektroforetický a chromatografický separační mechanizmus Kapilára je vyplněna vhodnou stacionární fází Náplňová – fáze uzavřena mezi dvěma fritami Monolitická – zpolymerováním monomerů uvnitř kapiláry se vytvoří blok porézního polymeru – monolit (polybutylmethakrylát x ethylendimethylakrilát , polystyren x divinylbenzen)

Elektrochromatografie (EC) Mobilní fáze uvnitř kapiláry je hnána EOF Neutrální analyty interagují se stacionární fází v koloně obdobně HPLC Analyty iontové povahy interagují se stacionární fází jako neutrální látky a navíc je jejich separace ovlivňována rozdíly v jejich efektivních mobilitách CEC se díky vysoké separační schopnosti, snadné přípravě monolitických kolon a použitelnosti pro neutrální i nabité analyty využívá při Analýze léčiv Opticky aktivních látek Biologických látek jako jsou proteiny a štěpy ribonukleových kyselin

Izoelektrická fokusace (IEF) IEF dělí látky amfolytické povahy na základě jejich izoelektrického bodu v lineárním gradientu pH Lze realizovat v plošném uspořádání v gelu v křemenné separační kapiláře bez gelu naplněné vhodným nosným amfolytem – kapilární izoelektrické fokusování Aby se eliminoval EOF pokrývá se vnitřní povrch kapiláry vrstvičkou hydroxyethylcelulosy Amfolyty mohou podle pH nést kladný, záporný nebo žádný náboj (bílkoviny, peptidy, aminokyseliny) Izoelektrickým bodem rozumíme takové pH, při kterém má molekula nulový náboj a proto žádnou elektroforetickou pohyblivost

Izoelektrická fokusace (IEF) Před separací se naplní kapilára roztokem dělených analytů rozpuštěných v nosném amfolytu, který je schopen tlumit celý rozsah pH Jako nosné amfolyty se používají směsi polyaminopolykarboxylových nebo sulfonových kyselin Konce kapiláry se ponoří do nádobky s katolytem a katodou(20mm/l NaOH) a anolytem a anodou (6 mmol/l H3PO4). Po vložení separačního napětí migrují na vstupu OH- ionty a z opačného konce H3O+ a vytvoří v nosném amfolytu klesající spojitý lineární gradient pH Analyty migrují podle náboje do svého izoelektrického podu (pH=pI), kde se zastaví a fokuzují Po fokuzaci se nahradí anolyt (H3PO4) roztokem NaCl a do výstupního konce začnou migrovat Na+ ionty místo H3O+ , začne se posouvat gradient pH a zóny fokuzovaných analytů se vytlačí z kapiláry přes UV detektor Pro jednotlivé analyty se získají „píky“ různé šířky

Kapilární izotachoforéza (ITP) Nejstarší kapilární metoda pro separaci iontů Používá se separační kapilára , která negeneruje EOF (PTFE, křemen s vrstvičkou hydroxyethylcelulózy) Dva separační tlumivé roztoky – vedoucí (leading) a koncový (terminatig) Vedoucí elektrolyt obsahuje koiont stejného znaménka jako analyty a velkou elektroforetickou pohyblivost Koncový elektrolyt obsahuje koiont opět stejného znaménka jako analyty, ale malou pohyblivost Vzorek se dávkuje mezi ně a vytvoří mezi nimi rozhraní

Kapilární izotachoforéza (ITP) Po spuštění separačního napětí začnou všechny analyty a kionty putovat stejnou elektroforetickou rychlostí směrem k detektoru Během migračního procesu se ionty ze vzorku řadí za koiontem vedoucího elektrolytu podle svých elektroforetických pohyblivostí a vytváří vlastní, ostře ohraničené a na sebe navazující zóny Každý ion vytváří vlastní zónu. Zóny jsou seřazeny podle klesající elektroforetické pohyblivosti mezi zónami vedoucího a koncového elektrolytu a prochází detektorem Detegoval lze jen jeden druh ionů – kationty nebo anionty Detektor monitoruje elektrickou vodivost jednotlivých zón

Kapilární izotachoforéza (ITP) Izotachoforegram má schodovitý průběh, každý schod- jeden analyt. Koncentrace analytů v zónách se přizpůsobí koncentraci koiontu ve vedoucím elektrolytu Výška (vodivost) je mírou kvality, délka je mírou kvantity Nepolární látky a opačně nabité ioty neruší Dnes se využívá hlavně Obsah kyselin v silážích, rozbor vody pro měření elektroforetických pohyblivostí Prekoncentrační krok před CZE