A JEJÍ LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA ATOPIE, ALERGIE A JEJÍ LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA

ZÁKLADNÍ TYPY PŘECITLIVĚLOSTI I. IgE-zprostředkovaná II. Cytotoxická, zprostředkovaná protilátkami IgG a IgM proti antigenům přítomným na povrchu buněk a tkání III. Cytotoxická, zprostředkovaná imunokomplexy vzniklými ze solubilních antigenů IV.Pozdní - zprostředkovaná aktivovanými T lymfocyty a makrofágy, které produkují po kontaktu s antigenem řadu cytokinů a mediátorů zánětu V.Receptorová - způsobená antireceptorovými protilátkami

dispozice pro vznik alergického onemocnění ATOPIE dispozice pro vznik alergického onemocnění ALERGIE nepřiměřená odpověď (reaktivita) na alergenní stimul reakce přecitlivělosti navozená imunologickými mechanismy klinické projevy: respirační (rýma, bronchitida, astma bronchiale) kožní (atopický ekzém, dermatitida) zažívací (potravinová alergie) jiné (oční projevy atd.)

ALERGENY antigeny vnějšího prostředí reagující s IgE protilátkami na povrchu efektorových buněk a mající schopnost vyvolat přecitlivělost I. typu. velmi různorodá skupina zahrnující vše, co člověka obklopuje v pracovním procesu, doma i venku. velká část alergenů byla izolována, strukturně analyzována i připravena synteticky rekombinantní technikou – byla zavedena speciální nomenklatura: první 3 písmena charakterizují rod, další písmeno druh a číslo popisuje pořadí, v jakém byly jednotlivé alergeny purifikovány příklad: Betula verrucosa (bříza) má alergen Bet v 1 Artemisia vulgaris (pelyněk) má Art v 1, Art v 2 a Art v 3

PŘÍČINY VZNIKU ALERGICKÝCH ONEMOCNĚNÍ nízká expozice bakteriálním antigenům v časných fázích ontogeneze tzv. „hygienická teorie“ – sterilní prostředí, antibiotika silná, předčasná expozice alergenům v časných fázích ontogeneze – kojení, potravní zvyky znečištění zevního prostředí vně budov (saze, výfukové plyny aj.) uvnitř budov (formaldehyd, tabákový kouř aj.) genetická predispozice – geny pro některé cytokiny, HLA systém

konjunktivitida, rhinorhea, kýchání, nosní blokáda, přetrvávající Histamin, LT, PG eosinofil IL-5 Y IL-4 B lymfocyt IgE produkce mastocyt dendritická buňka Th2 lymfocyt alergen Akutní alergická reakce konjunktivitida, rhinorhea, kýchání, pískoty, (urticarie) Chronická alergická nosní blokáda, přetrvávající pískoty, (ekzém)

NEJVÝZNAMNĚJŠÍ SKUPINY ALERGENŮ: pyly - (stromy, keře, trávy, byliny) Bet v 1 Art v 1,2,3 Dac g 1,5

NEJVÝZNAMNĚJŠÍ SKUPINY ALERGENŮ: roztoči – součást bytového prachu – významný inhalační alergen Dermatophagoides pteronyssinus Der p1, Der p2

NEJVÝZNAMNĚJŠÍ SKUPINY ALERGENŮ: včely a vosy – jed Apis Api m 1-6 Vespula Ves v 1-5

NEJVÝZNAMNĚJŠÍ SKUPINY ALERGENŮ: prach – komplexní alergen skládající se z odpadlých částeček předmětů a látek, epitelií lidí a zvířat, vlasů, chlupů, mikroorganismů, výměšků a části těl zvířat, hmyzu. Blattella germanica Bla g 1-5

NEJVÝZNAMNĚJŠÍ SKUPINY ALERGENŮ: domácí a zemědělská zvířata – epitelie, trus, peří

NEJVÝZNAMNĚJŠÍ SKUPINY ALERGENŮ: plísně (Alternaria, Aspergillus, Cladosporium) a další mikroorganismy

NEJVÝZNAMNĚJŠÍ SKUPINY ALERGENŮ: vodní řasy a sinice

NEJVÝZNAMNĚJŠÍ SKUPINY ALERGENŮ: potraviny – významný vliv má úprava mléko, vejce, ryby, korýši, maso, obilniny, ořechy, luštěniny, ovoce, zelenina, kakao a čokoláda ...) potravinová aditiva (barviva, konzervační látky, kontaminanty) léky (kys. acetylsalicylová, anestetika, antibiotika, myorelaxancia) alergeny pracovního prostředí (plastické hmoty, syntetická a přírodní vlákna, latex ...)

ALERGENY alergeny lze využít i pro léčbu atopie : hyposensibilizace či specifická imunoterapie alergenem: ovlivnění regulačních mechanismů imunity posunem od Th2 k Th1 a tím inhibice syntézy IgE pomocí opakovaného podávání vybraných alergenů podle určitého schématu

DIAGNOSTIKA ALERGIE Anamnéza (osobní a rodinná) Klinický obraz Kožní testy aplikace specifického alergenu intradermálně odezva in vivo

KOŽNÍ TESTY

LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA Základní laboratorní testy (basofily, eosinofily, celkové IgE...) Doplňující testy (specifické IgE,IgG,IgG4, ECP) Speciální testy (test uvolnění histaminu, CAST ELISA, basotest, tryptáza aj.) Měření alergenové zátěže v pracovním nebo domácím prostředí

CELKOVÉ IgE Indikace: jeden ze základních testů pro screening atopických stavů - koncentrace IgE v séru se významně zvyšuje u atopiků a koreluje s klinickými obtížemi časný test pro predikci atopie u novorozenců pomocný parametr pro diagnostiku a monitorování parazitóz diferenciálně diagnostický nástroj pro vrozené imunodeficitní stavy (hyper IgE syndrom aj.) Dospělá populace pod 200 IU/ml v séru Metody : ELISA, FEIA, nefelometrie ...

Celkové IgE – LUMINISCENČNÍ ENZYMO - IMUNO ANALÝZA (LEIA) Sch. 10.45

Celkové IgE - LUMINISCENČNÍ ENZYMO - IMUNO ANALÝZA (LEIA)

SPECIFICKÉ IgE hledání solubilní frakce IgE namířené proti konkrétnímu alergenu koncentrace vyjádřena v arbitrárních jednotkách IU/ml nebo semikvantitativně v tzv. RAST třídách 0 – VII (O – normální hladina specifického IgE, VII – velmi vysoká hladina nad 100 IU/ml) cílený test na základě anamnézy, kožních testů Indikace: doplňující vyšetření ke kožním testům odlišení typu přecitlivělosti u pacientů, kde kožní testy jsou omezeny (děti, kožní komplikace, systémová terapie glukokortikoidy aj.)

MOŽNOST TESTOVÁNÍ VELKÉ ŠKÁLY ALERGENŮ I - hmyz G - trávy (pyly) W - byliny (pyly) T - stromy (pyly) M - plísně F - potraviny D - roztoči E - epitelie (srst, peří) H - prach C - léky

METODY ANALÝZY CAP (FEIA se speciálním polymerním nosičem) EAST (ELISA na papírovém nebo acetylcelulózovém nosiči - disku) Capture metody (eliminují interferenci vysokých hodnot specifického IgG) Screeningové skupinové testy (testování stabilní sestavy alergenů v jednom kroku)

SPECIFICKÝCH IgE PROTILÁTEK EAST – PRŮKAZ SPECIFICKÝCH IgE PROTILÁTEK Sch. 10.35

EAST – průkaz specifických IgE protilátek

ADALTIS – ZAŘÍZENÍ NA „CAPTURE“ METODU S KAPALNÝMI ALERGENY

F E I A Sch. 10.44

CAP SYSTÉM PHARMACIA

ALERGENY PRO „IN VITRO“ DIAGNOSTIKU

SPECIFICKÉ IgG4 stanovení specifických protilátek proti alergenu v podtřídě IgG4 tzv. blokující protilátky - kompetují o vazbu na alergen se specifickým IgE, neaktivují komplement Indikace: vhodné především pro sledování účinku specifické imunoterapie, kde je očekáván jejich vzestup metody shodné se stanovením specifického IgE (EAST,CAP) výsledek analýzy vyjádřen nejčastěji v mg specifického IgG4/ml

SPECIFICKÉ IgG stanovení specifických protilátek ve třídě IgG proti různým antigenům a alergenům Indikace: použití testu pro jiné typy přecitlivělosti než zprostředkovaný IgE reakce na očkování reakce na léky potravinové intolerance omezený sortiment antigenů výsledek vyjádřen v mg specifického IgG /ml metody stanovení : ELISA

STANOVENÍ MEDIÁTORŮ citlivější než stanovení IgE protilátek odráží okamžitý stav organismu hladiny se velmi rychle mění důležité je správné načasování odběru, správné provedení odběru, transportu a zpracování vzorku – nebezpečí ovlivnění výsledku např. lýzou leukocytů v praxi hlavně stanovení eosinofilního kationového proteinu (ECP)

EOSINOFILNÍ KATIONOVÝ PROTEIN (ECP) jeden ze zánětlivých mediátorů uvolňovaných z eosinofilů vhodný parametr pro monitorování alergického zánětu indikace: posouzení závažnosti astmatu nebo ekzému monitorování terapie hodnocení – normální hodnoty pod 15 ugll metody: CAP systém LEIA (Lumino-enzymo-imunoanalýza)

TRYPTÁZA jedna z hlavních proteáz mastocytů, pomáhá uvolňovat většinu biologických mediátorů (proteáz a cytokinů) existují dva typy tryptáz: alfa a beta alfa forma se uplatňuje při mastocytóze beta forma je obsažena v granulích mastocytů a uvolňuje se při alergické reakci beta forma - parametr pro monitorování alergického zánětu metoda stanovení – CAP FEIA indikace: monitorování časných fází zánětu (spolu s histaminem, ale stanovení histaminu je technicky obtížné) pomocný parametr při nevyjasněných anafylaxích

- FUNKČNÍ TESTY „IN VITRO“ METODY NOVÉ GENERACE - FUNKČNÍ TESTY „IN VITRO“ Test uvolnění histaminu (Histamin release test - HRA) Test na syntézu sulfidoleukotrienů (CAST ELISA) Basotest

CAST ELISA stimulace leukocytů „in vitro“ pomocí specifického alergenu a IL3 a následné měření uvolněných sulfidoleukotrienů sLT (LTE4, LTC4,LTD4) výsledek je vyjádřen jako koncentrace mediátorů (sLT) v pg/ml za významné se považují hodnoty nad 200 pg sLT/ml alergeny: cca 35 léků, 14 potrav. Aditiv, 25 potravin a další běžné alergeny (výrobce Buhlmann) indikace: jiné testy není možné provést nebo je diskrepance mezi nimi vhodné pro diagnostiku latexové alergie test s vysokou sensitivitou pro diagnostiku polékových alergií a reakcí, zvláště na betalaktamová antibiotika, myorelaxancia, analgetika, acylpyrin a další

TEST UVOLNĚNÍ HISTAMINU stimulace leukocytů „in vitro“ specifickým alergenem a následné měření uvolněného histaminu výsledek je vyjádřen jako množství histaminu v % z celkového množství histaminu přítomného v buňkách vzorku Indikace: jiné testy není možné provést nebo je diskrepance mezi nimi konfirmační (potvrzovací ) test pro některé typy hmyzích a potravinových alergií vhodné pro diagnostiku lékové alergie

BASOTEST (TEST AKTIVACE BASOFILŮ) stimulace basofilních granulocytů v plné krvi „in vitro“ specifickým alergenem a následné měření jejich aktivace Vyhodnocení se provádí pomocí průtokového cytometru a dvoubarevné fluorescence (dvě protilátky - jedna je namířena proti znaku typickému pro basofily - anti-IgE a druhá indikuje úroveň aktivace basofilů – anti-gp53 (CD63)) výsledek je vyjádřen jako množství aktivovaných (degranulovaných) basofilů v % Indikace: testování přecitlivělosti I. typu dobře koreluje s testem uvolnění histaminu (HRA)

MĚŘENÍ MNOŽSTVÍ ALERGENŮ V PROSTŘEDÍ (DOMÁCÍM, PRACOVNÍM) objektivní údaj o výskytu a koncentraci konkrétních alergenů v prostředí (nejčastěji roztoči, epitelie koček, psů) slouží k monitorování úklidových a alergen eliminačních opatření měření se většinou provádí ze standardně odebraného prachového vzorku (koberce, polštáře, matrace aj.) např. speciálním nástavcem na vysavač detekce pomocí imunoanalýzy s použitím monoklonálních protilátek namířených proti konkrétním molekulám alergenů (Der p1, Fel d1, Can f1 aj.) existují i rychlé screeningové testy normální hodnoty: Der p1,Fel d1 < 400ng/g prachu, Can f1 < 10ug/g prachu výrobce např. INDOOR technologies (cena pro jeden vzorek cca 800-1000 Kč)