Indukce apoptózy hematopoetických buněk ionizujícím zářením D.Vokurková1, J.Vávrová2, M.Řezáčová3, S.Filip4, J.Šinkora5 1 Ústav klinické imunologie a alergologie, Fakultní nemocnice a Lékařská fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze 2 Katedra radiobiologie, Fakulta vojenského zdravotnictví UO, Hradec Králové 3 Ústav lékařské biochemie, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze 4 Klinika onkologie a radioterapie, Fakultní nemocnice a Lékařská fakulta UK, Hradec Králové 5 DakoCytomation AG,Brno

Cíl práce Prozkoumat mechanismy buněčné smrti u hematopoetických buněk za využití flow-cytometrických metod Zavést flow-cytometrické metody ke stanovení apoptózy u hematopoetických buněk, které by mohly být využity k diagnostice obdržené dávky u osob ozářených při radiačních nehodách Apoptóza neboli programovaná buněčná smrt je významný způsob buněčné smrti představující hlavní regulační mechanismus pro odstranění nadbytečných a nechtěných buněk během embryonálního vývoje, růstu, diferenciace a normální buněčné obnovy. Při optimální organizaci umírá za normální den přibližně 10 bilionů buněk a právě takové množství buněk se tvoří při mitóze. Apoptóza je nutná k likvidaci buněk napadnutých patogeny, ale také k likvidaci aktivovaných či auto-agresivních imunitních buněk.

potenciálně letální poškození Zánik buňky po ozáření Poškození DNA úplný zlom dvojvlákna Jednoduché zlomy (SSB) potenciálně letální poškození DSB subletální poškození Reparace je možná mutace ! reparace Komplexní DSB Po ozáření buněk ionizujícím zářením (gama, RTG, neutronové) dochází ke vzniku jednoduchých a dvojitých zlomů DNA. Zatímco jednoduché zlomy umí buňka rychle reparovat, reparace dvojitých zlomů je složitá. Výsledkem nedostatečné reparace jsou potom mutované buňky s poškozeným genomem nebo iniciace apoptózy. Reparace buněčného poškození je lepší v případě frakcionace dávky záření či ozařování s nízkým dávkovým příkonem. Reparace velmi nesnadná APOPTÓZA Frakcionace dávky Ozáření s nízkým dávkovým příkonem

Hematopoetické kmenové buňky Buněčná smrt NEKRÓZA APOPTÓZA Zvětšení buněk Desorganizace Lýza (Programovaná buněčná smrt) Kondenzace cytoplazmy Zmenšení buněk Fragmentace DNA Apoptická tělíska Jedním z časných procesů v indukci apoptózy je dehydratace buněk. Ztráta intracelulární vody vede ke kondenzaci cytoplazmy a výsledkem jsou změny tvaru a velikosti buňky, buňky se prodlužují a celkově jsou menší. Další změnou, která charakterizuje apoptózu, je kondenzace jaderného chromatinu. Jaderná membrána je narušena, laminy podléhají proteolytické degradaci, následované jadernou fragmentací. Mnoho jaderných fragmentů, které se barví DNA barvami nalézáme v cytoplasmě jako kousky různé velikosti a jsou zodpovědné za pokles obsahu DNA v jádře. Jaderné fragmenty spolu s částí cytoplazmy (zahrnující i intaktní organely) se opouzdří a tvoří v cytoplazmě typické struktury. Tyto struktury byly nazvány apoptická tělíska a tvoří se, když buňky umírají. Peripherní lymphocyty jsou také buňky, které jsou v krvi přítomny v Go fázi buněčného cyklu.Jsou však velmi citlivé k účinku záření. Ve vlastní práci jsme prokázali, že jak kmenové buňky krvetvorby, tak periferní lymfocyty hynou do 72 hodin po ozáření apoptózou. Lymfocyty Hematopoetické kmenové buňky

Metody stanovení apoptózy Morfologická detekce apoptózy na cytospinových preparátech barvených Giemza-Romanovski Identifikace podle kondenzace a fragmentace jader a protruzí buněčného povrchu Stanovení velikosti a granularity buněk (side a forward scater) Analýza přítomnosti fosfatidylserinu (PS) na povrchu buněk použitím APOPTESTU TM -FITC (DAKO) pro dvojí značení Annexin V- FITC (vazba k PS) a propidium jodid (detekující jadernou DNA) Stanovení mitochondriálního antigenu APO 2.7 bez a s permeabilizací Flow-cytometrická analýza buněčného cyklu a stanovení sub-diploidního obsahu DNA (sub-G1 buňky) Kromě morfologické detekce apoptózy buněk pozorovatelné pod mikroskopem, jsou ostatní metody prováděné na průtokovém cytometru, kde je možné i bez pomoci fluorochromu pozorovat změnu velikosti agranularity apoptických buěk, jak uvidíme na pozdějším snímku. Pokud sledované buňky označíme protilátkou s navázaným fluorochromem, tak po ……….navázání na detekovaný receptor a dopadem laserového paprsku dojde k emisi a následné excitaci navázaného fluorochromu, který pozorujeme jako posun fluorescence. Na tomto principu je založeno stanovení fosfatidylserinu značeného fluorochromem FITC (izothiocyanát). Stanovení buněčného cyklu využívá schopnosti PI vázat se stechiometricky na šroubovici DNA a stanovit jednotlivé fáze buněčného cyklu, kde apoptický proces je charakterizován vznikem subG1 peaku.

Indukce apoptózy Lidská promyelocytární leukémie - HL-60 Lidská T-lymfocytární leukémie - MOLT-4 Hematopoetické kmenové buňky Lymfocyty z periferní krve zdravých dárců Lymfocyty z periferní krve pacientů s maligním onemocněním po ozařování Nejprve jsme sledovali indukci apoptózy vyvolanou ionizujícím zářením u modelových leukemických linií HL-60 (lidská promyelocytární leukémie) a MOLT-4 (lidská T-lymfocytární leukémie), hematopoetických kmenových buněk a dále u lidských lymfocytů izolovaných z periferní krve zdravých dárců ozářených in vitro a později na lidských lymfocytech izolovaných z periferní krve pacientů s maligním onemocněním ozařovaných v rámci terapie.

LIDSKÁ PROMYELOCYTÁRNÍ LEUKÉMIE HL-60 D0 = 2, 2 Gy Rychlá interfázová smrt časná apoptóza Dávky nad 10 Gy Buňky umírají z fáze cyklu kde byly ozářeny Mitotická smrt oddálená apoptóza Zástava buněčného cyklu v S fázi a G2 fázi Reparace poškození Ozařování v G2 fázi zvyšuje radiorezistenci buněk Zkrácení bloku v G2 fázi - radiosenzibilizující efekt Do – přežívá 37% buněk

HL-60 – 20 Gy - změny zastoupení buněk v buněčném cyklu a indukce apoptózy hodnocená podle subG1 vrcholu bez reparace Rychlý nástup interfázové apoptózy G1=44% S= 44% G2=12% A=2% A=12% A=87% A=48% G1=47% K 2 4 6 24 Čas po ozáření (h)

HL-60 – 6 Gy - změny zastoupení buněk v buněčném cyklu a indukce apoptózy hodnocená podle subG1 vrcholu reparace poškození oddálená (postmitotická) apoptóza G1=42,2% S =45,4% G2=12,4% K 6 h 24 h 72 h 85% 62% 144 h Oddálená apoptóza

Šetřící efekt ozařování s nízkým dávkovým příkonem na buňky HL-60 (reparace poškození v G2 bloku) 41 h O 10Gy G 2=73% G 2=10% 65 h 89 h 161 h K G1=42,2% S =45,4% G2=12,4% NO 10Gy Vliv ozáření s vysokým-0,6 Gy /1 minutu (O) a nízkým - 3,9 mGy /1minutu (NO) dávkovým příkonem na průběh buněčného cyklu a indukci apoptózy u buněk HL-60 ozářených dávkou 10 Gy. Čas představuje dobu od začátku ozařování .Skupina ozařovaná nízkým dávkovým příkonem byla ozařována 41 hodin. Z obrázku je patrno, že v konci dlouhodobého ozáření dávkou 10 Gy jsou všechny buňky v G2 fázi a reparují radiační poškození. Dávka není absolutně letální jako je to v případě jednorázového ozáření s vysokým dávkovým příkonem. 161 h po začátku ozařování jsou již přítomny prakticky všechny živé buňky

LIDSKÁ T- LYMFOCYTÁRNÍ LEUKÉMIE MOLT-4 D0=0,8 Gy velká radiosenzitivita p53 wild typ relativně rychlá indukce apoptózy bez dlouhého bloku v G2 fázi

MOLT-4 – 3 Gy - Flow cytometrické stanovení obsahu DNA a buněčného cyklu 24 hodin po ozáření Apoptotické buňky

Dávková závislost indukce apoptózy (detekované pomocí APO2 Dávková závislost indukce apoptózy (detekované pomocí APO2.7) za 16 hodin po ozáření 16 hodin po ozáření buněk MOLT-4 vykazuje nárůst APO2.7 pozitivity lineární dávkovou závislost v rozmezí dávek 0.2-5 Gy.

Časová závislost indukce apoptózy po dávce 1 Gy K 1. 3. 6. 14. den FSxSS A/CD7 % A+ 11 36 47 24 12

Závěr – leukemické linie Buňky MOLT-4 jsou citlivější k indukci apoptózy vyvolané ionizujícím zářením Malý blok v S a G2 fázi (malá reparace poškození) Význam proteinu p53 pro indukci apoptózy Buňky HL-60 jsou radiorezistentnější Bez p53 Dlouhý blok v G2 fázi, reparace poškození Ozařování s nízkým dávkovým příkonem má šetřící efekt, stoupá radiorezistence (D0), reparace poškození v G2 bloku probíhá již v průběhu ozařování

KMENOVÉ BUŇKY KRVETVORBY 85% vliv ionizujícího záření na kmenové buňky krvetvorby izolované z periferní krve zdravých dárců po mobilizaci G-CSF - izolovány na separátoru PKB obsahovaly 0,5-1% CD133+ buněk, dále izolovány imunomagnetickou selekcí pomocí imunomagnetických partikulí izolující CD133 pozitivní buňky Z obrázku je patrno, že takto izolované buňky jsou z 80% CD133+/CD34+ a jsou to buňky s malým SS

Expanze CD133+ buněk (SCF, IL-3,FLT3-L) ex vivo Z obrázku je patrno, že po vyplavení kmenových buněk do periferní krve pomocí mobilizace G-CSF a jejich separaci, nejprve na separátoru Cobe a dále mini MACS systémem, jsou prakticky všechny buňky v klidové G0/G1 fázi. Za 24 hodin po začátku expanze se objevilo 5% buněk v S fázi a 7. den po začátku expanze bylo již 35 % buněk v S fázi, což značí, že buňky proliferovaly. Buňky izolované imunomagnetickou separací jsou prakticky všechny v G0 fázi buněčného cyklu. Za 168 h po začátku expanze je 35% buněk v S fázi

Průběh buněčného cyklu a indukce apoptózy u buněk CD133+ ozářených in vitro 2,5 Gy a expandovaných ex vivo v přítomnosti cytokinů IL-3 + SCF + FLT3-L S=35% Průběh buněčného cyklu a indukce apoptózy u buněk CD133+ ozářených in vitro 2,5 Gy a expandovaných ex vivo v přítomnosti cytokinů IL-3 + SCF + FLT3-L. Z obrázku je patrné, že 24 h po ozáření je 60% buněk apoptických, maximum apoptózy bylo 72 h po ozáření (80%). 24 hodin po in vitro ozáření buněk dávkou 2,5 Gy bylo 60% buněk se subdiploidní DNA, což představuje buňky apoptické a 72 hodin po ozáření bylo apoptických 80%. Pod vlivem kombinace cytokinů SCF+IL-3+FLT3L přežívajících 20 % buněk vstoupilo do buněčného cyklu a podobně jako u neozářené skupiny 7. den po ozáření bylo 35 % buněk v S fázi buněčného cyklu. Výsledky ukazují, že je možné vhodnou kombinací cytokinů u části buněk zabránit indukci apoptózy KBK vyvolané ionizujícím zářením a indukovat vstup těchto buněk do buněčného cyklu. 24h po ozáření je 60% buněk apoptických, maximum apoptózy bylo 72 h po ozáření (80%)

LIDSKÉ LYMFOCYTY Izolace z periferní krve In vitro ozáření Stanovení apoptózy (Annexin V) Změny počtu NK buněk Chtěli jsme zjistit, jak probíhá indukce apoptózy u lidských lymfocytů periferní krve a která z lymfocytárních subpopulací je nejvíce radiosenzitivní a tudíž by byla vhodná jako biodozimetrický marker ke stanovení obdržené dávky záření. V tomto případě jsme zvolili metodu detekce apoptózy stanovením fosfatidylserinu Annexinem FITC. Tato metoda je vhodná ke kombinaci s povrchovým značením lymfocytárních subpopulací.

Metoda stanovení anexinu V - indukce časné fáze apoptózy Buněčné změny v procesu apoptózy vedou ke ztrátě asymetrie membránových fosfolipidů během časné fáze apoptózy U živých buněk je phosphatidylserin (PS) na vnitřní straně buněčné membrány Během apoptózy je PS transportován na vnější stranu buněčné membrány a je přístupný pro vazbu annexinuV v přítomnosti Ca2+ iontů Metoda umožňuje současné stanovení povrchových znaků lymfocytů spolu s annexinem V

Dynamika indukce apoptózy lidských lymfocytů (CD45+/CD14-) po in vitro ozáření dávkou 7 Gy Anexin V pozitivita A+ A+/PI+ Anexin V a propidium jodid pozitivita Výhodou á Nejprve jsme sledovali časovou závislost indukce apoptózy separovaných lymfocytů po in vitro ozáření 7Gy. K zagatování lymfocytů jsme použili kombinaci monoklonálních protilátek CD45+/CD14-. Zjistili jsme, že po 16ti hodinách je indukce apoptózy příliš nízká a po 48hodinách zase naopak vysoká. Pro další sledování indukce apoptózy jsme zvolili časový interval 16 a 24hodin po ozáření.

ANNEXIN V – INDIKÁTOR DÁVKY ? Dávková závislost indukce apoptózy (detekované pomocí Annexinu V) za 16 hodin po ozáření V tomto grafu je vynesena závislost Annexin pozit. (apoptických) buněk na dávce záření. Vidíme, že nárůst apopt.bb je vyšší u populace CD3+/CD8+, což je označení cytotoxických/supresorických T lymfocytů, subpopulace pomocných T lymfo CD3+/CD4+ se zdá být radiorezistentnější. ANNEXIN V – INDIKÁTOR DÁVKY ?

Dávkově závislá indukce apoptózy lymfocytárních subpopulací ozářených dávkou 5Gy Dávková závislost vybraných lymfocytárních subsetů 16+48h po kultivaci in vitro. Počet intaktních CD3+CD4+ T buněk (prázdné čtverečky), CD3+CD8+ T buněk (černé kosočtverce) a CD3-CD8+ NK buněk (prázdné trojúhelníky) v ozářených vzorcích byl vydělen relativním počtem buněk v neozářených kontrolách, vypočtené hodnoty byly převedeny na procenta a vyneseny do grafu proti velikostem radiačních dávek. Průměrné hodnoty jsou získány ze 6 vzorků ± SD. Vložený obrázek v pravém horním rohu ukazuje typický dvouparametrový dot-plot histogram exprese CD3 versus CD8 v A-PI- populaci vzorku ozářeném 5G 16+48h kultivace.

NK buňky součást vrozené imunity asi 15% ze všech cirkulujících lymfocytů schopnost lyzovat cílové buňky časný zdroj imunoregulačních cytokinů podle density povrchového markeru CD56 – 2 odlišné populace 90% - nízkodensitní exprese receptoru CD56 (CD56dim) a zároveň exprese vysokoafinitního (FcgRIII,CD16) – CD56dim/CD16 hlavně cytotoxická aktivita 10% NK – CD56bright/CD16dim, CD56briht/CD16- produkce imunoregulačních cytokinů (IFNg) nízká přirozená cytotoxicita V některých pracech se sleduje podíl CD56dim/CD56bright -

Subpopulace CD3-/CD8+/CD56dim CD3-/CD8+/CD56bright

INDUKCE APOPTÓZY U LYMFOCYTŮ PO OZÁŘENÍ IN VIVO pacientka J. ozařována pro karcinom cervix uteri na lineárním urychlovači fotony s energií 6 MV ozařovaná na oblast břicha frakcionovaně do celkové dávky 38 Gy (2 Gy/frakci) původně plánovaná dávka 44 Gy vzhledem ke zdravotním komplikacím pacientky redukována na 38 Gy na obrázku znázorněno ozařovací pole

Změny počtu NK buněk v závislosti na čase u pacientky J. Relativní zastoupení NK buněk v gatu Annexin V negativních buněk nám poskytlo méně informací než při jejich studiu in vitro. Hluboký pokles byl patrný až po 12. frakci (24 Gy). Při frakcionovaném ozáření jsme výrazný pokles počtu NK buněk v živé subpopulaci pozorovali až po relativně vysokých dávkách. sloupečky představují vždy dávku záření 2 Gy

Vzestup počtu A+ NK buněk po frakcionovaném ozáření pacientky J Vzestup počtu A+ NK buněk po frakcionovaném ozáření pacientky J. 1 hodinu po ozáření (tmavě fialová křivka) a po 24 h in vitro inkubaci v termostatu (světle fialová křivka) V případě ozáření velkého objemu břicha (pacientka J.) po dvou frakcích (4 Gy) došlo k vzestupu apoptických NK buněk ze 40% na - 80% (24 h inkubace in vitro). V průběhu dalšího ozařování hodnoty A+ NK buněk byly na konstantní (80%) úrovni. parciální ozáření 2 Gy vede k mírnému (nesignifikantnímu) vzestupu Annexin+ NK buněk především po 24 h inkubaci in vitro

Populace CD56brightse zdá být citlivější než populace CD56dim Pokles relativního zastoupení NK buněk (CD3-/CD8+) a jejich subpopulací CD56dim a CD56bright po in vivo celotělovém ozáření pacientky dávkou 2 Gy. celotělová dávka 2 Gy vede k poklesu počtu NK buněk za 24 a především za 48 h po ozáření. Populace CD56brightse zdá být citlivější než populace CD56dim

Indukce apoptózy lymfocytů a NK buněk u pacientek s nádory endometria před a po ozáření malé oblasti břicha (box) 2 Gy Indukce apoptózy lymfocytů a NK buněk u pacientek s nádory endometria před a po ozáření malé oblasti břicha (box) 2 Gy. Dávka 2 Gy na relativné malou oblast břicha vede k vzestupu počtu apoptických NK buněk. U lymfocytů i T lymfocytů je vzestup po ozáření nevýrazný. Odpověd na ozáření je velmi nehomogenní.

Srovnání % zastoupení A+ NK buněk u zdravých dárců a pacientů s nádory – před terapií Výrazný vzestup Při studiu A+ buněk jsou zajímavé již výchozí hodnoty NK buněk. Zatímco počty A+ buněk u lymfocytů před ozáření se pohybují okolo 10%, v případě NK buněk je apoptických 30%, resp 40% po inkubaci 24 hodin. Počet A+ NK buněk pravděpodobně souvisí s nádorovým onemocněním. Nejvyšší vzestup indukce apoptózy u NK buněk pacientů s nádory ve srovnání se zdravými dárci krve. Vzestup apoptózy u lymfocytů i T lymfocytů byl méně patrný.

Závěr Dvoubarevná imunofenotypizace kombinovaná s analýzou navázaného Annexinu je dostatečná pro biodozimetrii v in vitro kultivovaných lymfocytech. Studium NK buněk při ozáření in vivo pacientů s nádory je komplikováno faktem, že NK buňky reagují zvýšenou apoptózou na přítomnost nádorových buněk a procento apoptických buněk je již před ozářením významně vyšší než u zdravých dárců. V případě ozáření pacientek s karcinomy endometria a čípku děložního technikou box (relativně malý objem oblasti břicha) došlo při 24 h inkubaci k relativně malému poklesu počtu NK buněk. Po celotělovém ozáření pacientky s hematologickou malignitou (2 Gy) jsme prokázali výrazný pokles NK buněk především 48 h po ozáření, což je v souladu s experimenty in vitro. Je tedy zřejmé, že doba inkubace po ozáření má zásadní význam pro průkaz poklesu NK buněk po malých dávkách záření. Práce vznikla za podpory grantu 202/04/0598 GAČR a MO ČR Záření II