Vysoké učení technické v Brně Laboratoře – Ústav fyziky KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE 2009

KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP LEXT 3100 Aplikace: Lomové plochy Vodivé i nevodivé materiály (polovodiče, keramika, plasty, povlaky, vrstvy a kovy) Analýza: Drsností Profilů Částic Objemová analýza přímo ve 3D zobrazení

PRVKY KONFOKÁLNÍHO MIKROSKOPU Optické prvky jsou uzpůsobené vlnové délce laseru o λ = 408 nm: Zdroj Objektiv Konf. opt. clonka Fotonásobič Detektor CCD (snímání barevného obrazu-RGB) fotoefekt

PRINCIP KONFOKÁLNÍHO MIKROSKOPU Osvětlení: Bodový zdroj světla (laserový paprsek fokusovaný na clonku) Clonka: Je objektivem mikroskopu zobrazena na vzorek, do bodu o průměru rovnajícím difrakční mezi mikroskopu čárkovaně: paprsky jdoucí z mimoohniskových rovin, zachycené clonkou. Objektiv: Sbírá světlo vzorkem odražené nebo rozptýlené Zpětný průchod objektivem: Obraz bodové clonky => fotonásobič => druhá konfokální bodová clonka (blokující)

HISTORIE KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE Marvin Minsky 1957 – patentoval nápad na konfokální mikroskopii, ale nenašel vhodný zdroj světla M. Petráň a M. Hadravský 1967 – Tandem Scanning Confocal Microscope Koncem 70. let – první spolehlivý konfokální mikroskop s rozmítaným laserovým paprskemm laserovým paprskem

SROVNÁNÍ S „KLASICKOU“ MIKROSKOPIÍ „Klasická“ mikroskopie: Předpokládá nekonečně malou tloušťku preparátu (vzorku) Při zkoumání silných vzorků je kvalita zobrazení nepříznivě ovlivňována překrýváním obrazu roviny, do níž je mikroskop právě zaostřen, s neostrými obrazy rovin ležících nad ní a pod ní. Lze zkoumat jen vzorky o tloušťce menší, než je hloubka ostrosti objektivu, která závisí na jeho numerické apertuře (Zmin= 0,25 nλ/NA2). Obrazem bodu není bod, ale tzv. Airyho kroužky Difrakční obrazec vzniká ohybem zobrazujícího se světla na čočkách objektivu. Při zobrazení blízkých bodů se mohou jejich Airyho kroužky překrývat, až se stanou téměř nerozlišitelnými.

SROVNÁNÍ S „KLASICKOU“ MIKROSKOPIÍ Konfokální mikroskopie tyto nevýhody odstraňuje nicméně má navíc výhody i nevýhody: Výhody: Potlačení mlhavého pozadí obrazu Optická tomografie Není limitována Rayleighovým kriteriem: (Obraz vzniká skládáním z jednotlivých bodů, které jsou navíc pozorovány přes clonku, jejíž rozměry bývají menší než průměr Airyho kroužků.) Nevýhody: Zatíženost statistickým šumem, jehož velikost je úměrná √N/N, kde N je počet detekovaných fotonů. Nelze snadno řešit zvýšením intenzity záření (Interakce s /fluorescenčním/ preparátem)

SROVNÁVACÍ SNÍMKY Nekonfokální mikroskop Konfokální mikroskop Rastrující konfokální mikroskop: U něj skenující zařízení zařizuje posun ohniska excitujícího laserového paprsku – velmi efektivní pro sestavování 3D modelů Rastrování (obraz celé zaostřené roviny se získává bod po bodu následovně): Rozmítáním laserového paprsku Příčným posuvem vzorku před objektivem Posuvem objektivu nad vzorkem Optické řezy: Optické řezy se pohybují v řádech mikrometrů (lze numerické apertury a využitého laseru)

PRACOVIŠTĚ ÚSTAVU FYZIKY

MĚŘENÍ A MODELOVÁNÍ Lomová plocha hydratované cementové pasty: Zvětšení 120 x Rastrů 250

MĚŘENÍ A MODELOVÁNÍ Lomová plocha hydratované cementové pasty: Zvětšení 480 x Rastrů 250

Děkuji za pozornost Děkuji za pozornost