Reprodukce buněk a buněčný cyklus Mitóza, meióza Chromozómy a jejich aberace 20.11.08 + 27.11.2008 + 4.12.2008 RNDr. Radek Trojanec, Ph.D. Mgr. Vladimíra Palková CYTOGENETICKÁ LABORATOŘ Laboratoř experimentální medicíny (LEM) www.LEM-Olomouc.cz

Reprodukce buněk a buněčný cyklus RNDr. Radek Trojanec, Ph.D. Mgr. Vladimíra Palková CYTOGENETICKÁ LABORATOŘ Laboratoř experimentální medicíny (LEM) www.LEM-Olomouc.cz

Buněčné dělení: proces, při kterém se mateřská buňka rozdělí na 2 LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Buněčné dělení: proces, při kterém se mateřská buňka rozdělí na 2 dceřinné Mitóza (rovnostní dělení) Meióza (redukční dělení) Amitóza (zaškrcení)

Mitogenní signalizace

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Buněčný cyklus (BC): sled dějů, vedoucí k rozdělení 1 buňky (mateřské) na 2 buňky dceřinné velice precizní kontrola, principy jsou podobné ve všech eukaryotních buňkách poruchy kontrolních mechanizmů BC mohou vést nádorovému bujení

Fáze BC eukaryotní buňky: LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Fáze BC eukaryotní buňky: Interfáze = G1, S a G2 fáze M-fáze = mitóza s cytokinezí

G1 fáze: intenzivní metabolismus, tvoří se ATP, RNA, LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Interfáze G1 fáze: intenzivní metabolismus, tvoří se ATP, RNA, proteiny a jiné metabolity S fáze: replikace DNA G2 fáze: příprava na mitózu, syntéza specifických proteinů, organizace cytoskeletu M fáze: dochází k mitóze, následnému zaškrcení a rozdělení celé buňky

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Systém regulace BC je řízen fosforylací klíčových proteinů, iniciujících nebo regulujících replikaci DNA, mitózu a cytokinezi. Fosforylační reakce zprostředkovávají proteinkinázy, které jsou přítomny v cytoplasmě v průběhu celého BC, aktivovány jsou však cyklicky vazbou na cyklin, tzv. cyklin-dependentní kinázy – CDK (koncentrace cyklinů se v průběhu BC mění)

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

Aktivita CDK je regulována: LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Aktivita CDK je regulována: navázáním/odbouráním cyklinu fosforylací cyklin-CDK komplexu (aktivační i deaktivační) vazbou inhibitorů (fungují i jako mol. chaperony-např. p21 a CDK4/6) účinnost CDK závisí na vytvoření komplexu s různými cykliny

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Regulace BC

Kontrolní body (checkpoints ) BC je sled jednotlivých kroků - LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE * Kontrolní body (checkpoints ) BC je sled jednotlivých kroků - může být přerušen/zastaven, není-li splněna některá z podmínek pro další vývin buňky. Např. Je DNA nepoškozena? Je okolí vhodné pro další růst buňky? Je buňka dostatečně připravena? (G2) (M) * * * (G1) Nejsou-li podmínky splněny, BC se zastaví v G1 kontrolním bodu. Kontrolní body G1, G2 a M

Tumor-supresorový gen TP53 pozastavení BC v kontrolním bodě G1/ jako reakce na poškození DNA a různé typy stresu protein p53 - jaderný fosfoprotein, transkripční faktor pro několik cílových genů se zásadním významem pro regulaci buněčného cyklu (CIP1/WAF1), reparaci poškození genetického materiálu (GADD 45 - Growth Arrest and DNA Damage), navození apoptózy (BAX ) CIP1/WAF1 - protein 21 (p21), váže se k cyklin-dependentním proteinkinázám a inhibuje jejich aktivitu v G1/S kontrolním bodě p21 může tlumit replikaci zpomalením postupu replikační vidlice, inhibuje katalitickou aktivitu PCNA-dependentní-DNA-polymerázy-delta GADD 45 – exprese indukována aktivním p53, interakce s PCNA – blokace replikace a oprav DNA Gen BAX (proapoptotický člen rodiny Bcl-2) – řízené navození apoptózy

Regulace BC pomocí TP53 LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

Průběh buněčného cyklu LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Průběh buněčného cyklu START (G1 fáze) Cykliny D (D1, D2, D3, D4) Preferenční k cdk4 a cdk6 Koncentrace neosciluje, exprese vzrůstá – mitogenní signál Během G1 dochází pomocí komplexu Cyklin D1/cdk4 k aktivaci RB1 uvolnění E2F transkripčních faktorů DNA syntéza

Regulace tumor supresorového genu RB1 LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

Průběh buněčného cyklu LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Průběh buněčného cyklu G1 / S fáze Cyklin E nutný pro iniciaci replikace, duplikaci centrozómu exprimován na konci G1 (E2F regulace) váže se k CDK2 na počátku S fáze je cyklin E degradován a CDK2 uvolněna pro cyklin A v další fázi -kontrolní bod p53 (viz předchozí text)

Průběh buněčného cyklu LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Průběh buněčného cyklu S fáze Cyklin A Exprimován od S-fáze až po M Váže se nejprve s CDK2 (S-fáze), později (G2/M) s CDK1 (CDC2) Exprese je aktivována E2F; komplex CDK2-cyklin A zpětně E2F inaktivuje (pozitivní zpětná vazba)

Průběh buněčného cyklu LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Průběh buněčného cyklu M (mitóza) Zajištění genetické identity dceřiných buněk, rovnostním dělením Vstup do M inicializován tvorbou komplexu cyklinu B s CDK1, kontrolujícího mikrotubulární aparát Cyklin B/CDK1 se kumuluje během S a G2 fáze v cytoplazmě, ale teprve na konci G2 je aktivován fosfatázou (do té doby neaktivní, fosforylován) – transport do jádra

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Za regulaci a kontrolu buněčné proliferace jsou odpovědné zejména 3 skupiny genů: protoonkogeny a tumor-supresorové geny, které mají zásadní význam pro regulaci buněčného dělení a mutátorové geny, které kontrolují stabilitu genomu (podílejí se na opravě chyb, získaných během replikace).

Poruchy buněčné proliferace / buněčného cyklu LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Poruchy buněčné proliferace / buněčného cyklu Přeměna buňky v buňku nádorovou je několika stupňový proces, při němž se kumulují mutace v protoonkogenech, tumor-supresorových genech a mutátorových genech. Mutace vedou k nekontrolovanému množení transformovaných buněk, což je hlavní rys maligního zvratu.

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Příklady cytogenetických aberací, ovlivňujících buněčné dělení /buněčný cyklus

Del p53: ztráta fce kontrolního bodu LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE t(9;22)(q34;q11) Philadelphia (Ph) chromozóm (Nowell, Hungerford,1962) BCR-ABL CML, ALL, AML, ST STI-571 (Glivec) t(11;14)(q13;q32) CCND1-IgH Del p53: ztráta fce kontrolního bodu

CEP 17 LSI Her-2/neu

Common Approaches to Targeting HER1/EGFR Various approaches are being investigated to target members of the HER family, particularly HER1/EGFR and HER2. These include receptor sub-type specific monoclonal antibodies (MAbs) and small-molecule TK inhibitors (TKIs), which target the HER axis either outside or inside the tumor cell, respectively. MAbs block the extracellular ligand-binding region of the receptor. Several MAbs are specific for either HER1/EGFR or HER2.1 Different antibody- based approaches use MAbs or HER ligands conjugated with cellular toxins.2 Small-molecule TKIs act at an intracellular level, inhibiting TK phosphorylation and preventing downstream receptor signaling. There are agents that inhibit HER1/EGFR specifically, HER1/EGFR and HER2, or all members of the HER family (pan HER-TK inhibitors).3-5 Agents are being developed to interfere with HER activity at a nuclear level by blocking signal transduction and/or translation. The most promising methods are antisense oligonucleotides, ribozyme-mediated DNA inhibition, and gene therapy.6 1. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. N Engl J Med. 2001;344:783-792. 2. Mendelsohn J, Baselga J. Oncogene. 2000;19:6550-6565. 3. Noonberg SB, Benz CC. Drugs. 2000;59:753-767. 4. Raymond E, Faivre S, Arman JP. Drugs. 2000;60(Suppl 1):15-23. 5. Arteaga C. J Clin Oncol. 2001;19:32s-40s. 6. Pedersen MW, Meltom M, Damstrup L, et al. Ann Oncol. 2001;12:745-760. P P TK inhibitors P Anti-ligand- blocking antibodies Ligand– toxin conjugates P Antibody– toxin conjugates Anti-HER1/EGFR- blocking antibodies Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. N Engl J Med. 2001;344:783-792; Mendelsohn J, Baselga J. Oncogene. 2000;19:6550-6565; Noonberg SB, Benz CC. Drugs. 2000;59:753-767; Raymond E, Faivre S, Armann JP. Drugs. 2000;60(Suppl 1):15-23; Arteaga C. J Clin Oncol. 2001;19:32s-40s; Pedersen MW, Meltom M, Damstrup L, et al. Ann Oncol. 2001;12:745-760.

Stanislav Rosypal: Úvod do molekularni biologie, Praha, 2006 LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Grafy, obrázky, schémata a texty apod. byly přejaty a zpracovány s použitím Alberts et al., Molecular biology of the cell, Garland Science, New York, 2002 Stanislav Rosypal: Úvod do molekularni biologie, Praha, 2006

Děkuji za pozornost Laboratoř experimentální medicíny LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Děkuji za pozornost Laboratoř experimentální medicíny Dětská klinika FN a UP v Olomouci Puškinova 6, 775 20 Olomouc www.LEM-Olomouc.cz