ZÁSADY ODBĚRU A TRANSPORTU BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU

Jedním ze základních pilířů oboru mikrobiologie je správný odběr materiálu k mikrobiologickému vyšetření. Adekvátní klinický materiál, jeho následné vyšetření podle zásad správné laboratorní praxe a v neposlední řadě jeho odpovídající klinická interpretace je důležitým zdrojem diferenciální diagnostiky a vhodného léčebného přístupu k pacientovi.  

Mikrobiologické vyšetření ale není pouze laboratorní záležitostí. Je nutné zdůraznit, že lékařská mikrobiologie není jen laboratorním oborem, ale i oborem, který je schopen aplikovat své výsledky do klinické praxe. Mikrobiologické vyšetření ale není pouze laboratorní záležitostí. Jeho prvopočátkem je odběr biologického materiálu, který je v rukou klinických pracovníků. Správně indikovaný a provedený odběr je základním předpokladem úspěchu mikrobiologického vyšetření. Na něj navazuje transport odebraného materiálu do laboratoře a vlastní mikrobiologické vyšetření. Každá z těchto tří složek má svoje specifika a je pro celkový úspěch stejně důležitá.

Mikrobiologické metody Odběr materiálu a mikrobiologické vyšetřovací metody spolu velmi úzce souvisí. Vyšetřovací metody jsou v tomto vztahu prioritní a většinou určují způsob odběru. Obecně lze mikrobiologické metody rozdělit na přímé a nepřímé.

Přímé mikrobiologické metody průkaz živého či mrtvého mikrobiálního původce, jeho částí, povrchových struktur, charakteristických látek jako jsou nukleové kyseliny, enzymy, toxiny a event. produkty metabolismu.

Přímé metody se dále dělí na: Mikroskopické zobrazení původce mikroskopem optickým (různé druhy barvení) nebo elektronovým. Jsou velmi rychlé, většinou ale s nízkou senzitivitou i specifitou. Lze je velmi dobře využít pro průkaz obtížně kultivovatelných patogenů, vyskytujících se v dostatečné kvantitě ve vzorku materiálu (např. anaerobní bakterie) a k získání dalších informací (např. zánětlivá reakce, poměrné zastoupení infekčních agens).

Kultivační pomnožení původce ve vhodných kultivačních půdách nebo tkáňových kulturách do množství způsobujících makroskopicky zřetelné projevy. Dostatečně senzitivní a specifické, většinou, ale pomalé.

Imunochemické detekce původce na základě reakce antigenu se specifickou protilátkou. Jako antigen se mohou uplatňovat jak somatické struktury, tak i exogenní produkty (např. toxiny Clostridium difficile). Reakce je viditelná makroskopicky (např. aglutinace, latexová aglutinace) nebo je detekována dalšími reakcemi (např. imunofluorescence, barevná enzymatická reakce – ELISA). Většinou vysoce senzitivní i specifické, rychlé, v bakteriologii ale omezeně využitelné.

Genetické průkaz DNA nebo RNA bakteriálního původce hybridizací nebo dnes nejčastěji různými druhy amplifikačních metod. Vysoce senzitivní, specifické i rychlé, zatím omezeně využitelné.

Chemické průkaz chemických látek charakteristických pro detekovaný mikroorganismus. Buď se jedná o součásti jejich těl (např. mastné a mykolové kyseliny) nebo produkty metabolismu (např. průkaz urey u gastroenteritid způsobených Helicobacter pylori). Senzitivní, specifické i rychlé metody, jejich využití je rovněž omezené. Až na výjimky vyžadují náročné přístrojové vybavení (plynové chromatografy, hmotnostní spektrometry).

Pokus na zvířeti V současné době je pro rutinní diagnostiku využíván velmi málo. Jeho použití je vázáno na dodržování přísných předpisů o ochraně zvířat proti týrání.

Nepřímé detekce reakcí makroorganismu na působení mikrobiálního původce Ve většině případů se jedná o stanovení protilátek různých tříd. K tomuto účelu se používá široká škála metod od prosté aglutinace, aglutinace na nosičích, komplement-fixační reakce až po imunochemické metody, z nichž jsou nejrozšířenější metody ELISA. Nepřímý (serologický) průkaz původce se používá především tam, kde je kultivační průkaz obtížný nebo zcela nemožný – nejčastěji ve virologii a parazitologii.

Odběr materiálu - základní principy správného odběru Čas u infekcí způsobených mikroorganismy je velice důležité správně načasovat odběr materiálu k mikrobiologickému vyšetření. Místo odběru materiálu souvisí s druhem infekčního procesu a jeho průběhem. Zde se nejvíce projeví erudice a zkušenosti ošetřujícího zdravotnického personálu. Správný odběr musí být proveden lege artis a asepticky – za sterilních kautel.

V případě bakteriálních infekcí je velmi vhodné odebrat relevantní materiál ke kultivaci ještě před zahájením aplikace antimikrobních přípravků. Dalším důležitým biologickým materiálem je krev, kterou je nutné odebrat opakovaně (aspoň 2-3 hemokultury) a to jak pro aerobní, tak anaerobní kultivaci.

Hemokultivace - doba odběru Obecné pravidlo odebrat krev co nejdříve po prvních klinických příznacích Více odběrů rozložit v čase zvětšení pravděpodobnosti zachycení bakterií

Správné načasování odběru U pacientek s intermitentní bakteriemií na začátku vzestupu teplotní křivky, popřípadě 1 hod. před jejím začátkem. Další 2 - 3 hemokultury je vhodné odebrat v 30-minutových intervalech. U pacientek s kontinuální bakteriemií se odebírají 3 - 4 vzorky v 15 – 30minutových intervalech nebo bezprostředně před podáním antimikrobního léčiva, pokud je již aplikován. Při negativním výsledku opakovat hemokultury v následujících dnech.

V případech pacientů s již aplikovanými antimikrobními přípravky je vhodné odebrat krev před jejich podáním a použít hemokultur s inhibitory antibiotik. Jako vhodné systémy pro kultivaci krve se jeví především automatizované hemokultivační systémy, pracující na principu detekce zplodin bakteriálního metabolismu.

Dezinfekce Místo vpichu 70% alkohol (odmaštění) jodové desinfekční prostředky nepoužívat kvarterní amonné soli (ajatin) ! Stěr z místa vpichu !?! Hemokultivační lahvička propichovací zátka 70% alkohol !!! Nepoužívat jodové desinfekční prostředky u lahviček do automatických systémů - negativně ovlivňuje detekci CO2 !!!

Transportní souprava – musí splňovat následující základní požadavky: umožnit odběr vzorku, zajistit přežívání mikroorganismů do doby, než dojde ke zpracování vzorku v mikrobiologické laboratoři, ochránit vzorek před vnější kontaminací, ochránit vnější prostředí před kontaminací vzorkem, jednoznačná identifikace vzorku a přenos nezbytných dat, většinou jsou tyto požadavky řešeny průvodkou v papírové podobě, může být i elektronický přenos dat.

Materiál odebíraný ke kultivačnímu vyšetření lze rozdělit do tří základních skupin:

Tekutý materiál - moč, krev, likvor, hnis, sputum a další tělesné tekutiny či tkáně v tekutém stavu. Odebírají se do sterilní nádoby v dostatečném množství (min. 0,5–1 ml). Velmi důležité je, aby použitá nádoba dobře těsnila a nemohlo dojít ke kontaminaci materiálu či naopak okolí a zdravotnického personálu. Pro některé tekutiny (např. moč, krev) jsou speciální nádoby s kultivační půdou.

Tuhý materiál - tkáně, stolice atd. Pro odběr platí stejná pravidla jako pro tekutý materiál.

Výtěry Slouží k odběru malého množství materiálu nebo tam, kde není možné odebrat materiál jiným způsobem. Základní výtěrovkou je sterilní špejle nebo drát na jehož konci je namotán chomáček vaty, která může být nasycena aktivním uhlím. Výtěrovka je uchovávána v plastové zkumavce nebo plastovém obalu. Před odběrem je vhodné namočit vatový konec ve sterilním fyziologickém roztoku, aby se zabránilo vyschnutí a odumření zachycených bakterií během transportu do laboratoře. Sice dražší, ale z hlediska záchytu bakterií výhodnější, jsou výtěrovky s transportním kultivačním polotuhým médiem. Tyto výtěrovky není nutné před použitím zvlhčovat a kultivační půda zlepšuje možnosti přežití transportu u většiny citlivých a kultivačně náročných bakterií.

Odběr materiálu k sérologickému vyšetření Pro sérologická vyšetření se odebírá 5-10 ml plné (srážlivé) krve, která se v laboratoři centrifuguje. Vlastní stanovení protilátek se provádí ze séra. Pro sérologickou diagnostiku infekčních onemocnění je velmi důležité sledovat dynamiku titru protilátek. Je tedy nutné odebírat dva vzorky, druhý s časovým odstupem 1-3 týdnů.

Základní principy odběru biologického materiálu k mikrobiologickému vyšetření lze definovat následujícími body: Na základě znalosti povahy a průběhu infekčního procesu odebrat právě ten materiál, v němž se infekční agens nalézá a lze ho nejsnáze prokázat. Správná technika odběru vhodnými nástroji a do vhodných odběrových nádob. Sterilní způsob odběru, aby nedošlo ke kontaminaci odebíraného vzorku. Odebírat materiál pokud možno před podáním antibiotik. Jestliže léčba již byla zahájena, je nutno na tuto skutečnost laboratoř upozornit. Opakovat odběr v případech, kdy jednorázové vyšetření neposkytuje záruku záchytu mikroba nebo dostatečnou možnost závěrečné diagnózy. Platí to zejména pro vyšetření sérologická, ale mnohdy také pro přímý průkaz infekčního agens.

Transport materiálu Obecně platí, že transport materiálu ke kultivačnímu vyšetření má být co nejrychlejší. Každá prodleva zmenšuje možnost diagnostiky, zejména v případě růstově náročných bakterií. Relativně nejlépe vydrží mikrorganismy podmínky a dobu transportu v tekutém materiálu a v hemokulturách. Hůře je na tom tuhý materiál a tkáně, které osychají. Tomu se dá zabránit transportem ve fyziologickém roztoku, což může vést při malých počtech bakterií k jejich vyplavení a falešně negativní mikroskopii. Nejvíce citlivé na dobu transportu jsou výtěrovky bez transportního média.

Většina bakterií podílejících se na patogenních procesech u člověka snáší bez problémů teplotu 4–8 C. Snížení teploty zpomalí jejich metabolické procesy a bakterie lépe vydrží nepříznivé podmínky. Bohužel, některé důležité patogeny jako například Neisseria gonorrhoeae nebo Neisseria meningitidis mohou již při této teplotě hynout. Naopak vyšší teplota (25–30 C) může v prostředí s dostatkem živin způsobit přemnožení některých bakterií, které jsou součástí běžné flóry a potlačení patogenních původců (např. koliformní tyčinky potlačí -hemolytické streptokoky). 

Moč – vzhledem k většinou snadné dostupnosti tohoto materiálu by jakékoliv skladování nemělo připadat v úvahu. Při transportu je nutné udržet pokud možno nízkou teplotu. V moči mohou být i fyziologicky přítomné bakterie a moč představuje dobrou kultivační půdu (může obsahovat glukosu a bílkoviny). Při vyšší teplotě (např. v letních měsících) dochází už během dvou hodin k pomnožení event. fyziologicky přítomných bakterií na vysoké kvantity a k falešně pozitivním výsledkům.

Hnis, putridní materiál, nekrotické tkáně – uchovávat při teplotě 4–8 C. Event. přítomné koliformní bakterie mohou být při vyšší teplotě příčinou kvasných procesů s tvorbou plynu a způsobit porušení obalu a kontaminaci jak odebraného materiálu, tak i okolí tímto materiálem. Stolice - uchovávat při teplotě 4–8 C z důvodu velmi vysokého rizika kvasných procesů a výše uvedených následků.

Výtěrovky bez transportního média – jakékoliv skladování podstatným způsobem snižuje pravděpodobnost záchytu původce. Doba od odběru materiálu do zpracování v laboratoři by neměla přesáhnout dvě hodiny. Výtěrovky s transportním médiem – transportní medium umožňuje přežívání většiny bakterií, uplatňujících se v patogenezi bakteriálních infekcí, v závislosti na jejich odolnosti a růstových vlastnostech. V každém případě by doba skladování a transportu neměla přesáhnout 24 hodin.

Výtěr tamponem bez transportního média     Klinický materiál Podmínky transportu Výtěr tamponem bez transportního média Jakékoliv skladování snižuje pravděpodobnost záchytu původce. Doba transportu by neměla přesáhnout 2 hodiny při 4 oC. Výtěr tamponem s transportním médiem Transportní médium umožňuje přežívání většiny bakterií, zachovává i jejich původní kvantitativní poměry. Doba skladování a transportu by neměla přesáhnout 24 hodin při teplotě 4 °C. Moč Vzhledem k většinou snadné dostupnosti tohoto materiálu by jakékoliv skladování nemělo připadat v úvahu (výjimečně až 18 hodin při 4 oC). I při transportu je nutné udržet nízkou teplotu. V moči mohou být v nízkém počtu přítomny bakterie bez klinického významu. Při vyšší teplotě (např. v letních měsících) dochází už během dvou hodin k jejich pomnožení na vysoké kvantity a k falešně pozitivním výsledkům (moč může obsahovat glukosu a bílkoviny, proto představuje dobrou kultivační půdu).  

Hnis, punktát, bioptický materiál Sputum Nutný rychlý transport. Uchováváním při 4 oC by mohlo dojít k úhynu náročnějších bakterií, při vyšších teplotách k nežádoucímu pomnožení kontaminující ústní mikroflóry a zkreslení kvantitativních poměrů. Hemokultura U lahviček do automatických systémů Bactec a BacT/Alert výrobci garantují možnost 24h inkubace při pokojové teplotě před vložením inokulované lahvičky do přístroje. Nízká teplota je v těchto případech nevhodná – prodlužuje dobu následné kultivace a tím i čas detekce pozitivního vzorku. Likvor Vzhledem k důležitosti tohoto materiálu je nutný co nejrychlejší transport do mikrobiologické laboratoře a jeho okamžité zpracování. Pokud nelze transport realizovat okamžitě, je možné ho inokulovat do lahvičky pro hemokulturu a ponechat při pokojové teplotě. Hnis, punktát, bioptický materiál Uchovávat při teplotě 4 °C. Přítomné bakterie mohou být při vyšší teplotě příčinou kvasných procesů s  tvorbou plynu a způsobit porušení obalu. Stolice Uchovávat při teplotě 4 °C z důvodu vysokého rizika kvasných reakcí.

Schéma časového průběhu mikrobiologického vyšetření